第五章 电泳技术.ppt

第五章 电泳技术 Electrophoresis 第一节 引言 一、概述 电泳：带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳（electrophoresis）。 在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带进而达到分离目的。 三、影响电泳分离的主要因素 粒子在电场中所受到的电荷引力 F引=E Q 在溶液中,运动粒子与溶液之间存在阻力 F阻=6πrηV 当F引=F阻时 EQ= 6πrηV V=EQ/6πrη 故粒子的泳动速度与电场强度和粒子所带电荷量成正比,而与粒子的半径及溶液的粘度(η)成反比。 迁移率 m（泳动度），指带电粒子在单位电场强度下的泳动速度） m = V/E = Q/6πrη 故迁移率仅与球形粒子所带电荷数量，粒子大小及溶液粘度有关而与电场强度无关。 1. 待分离生物大分子的性质 电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，其电泳迁移速度越快。 2. 缓冲液的性质 缓冲液的pH值 缓冲液的离子强度 缓冲液的粘度 缓冲液的pH 缓冲液的pH值会影响待分离生物大分子的解离程度，从而对其带电性质产生影响. 溶液pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大. 对于蛋白质等两性分子，缓冲液pH还会影响到其电泳方向，当缓冲液pH大于蛋白质分子的等电点，蛋白质分子带负电荷，其电泳的方向是指向正极。 离子强度 为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电荷以及缓冲液pH值的稳定性，缓冲液通常要保持一定的离子强度 一般在0.02－0.2 离子强度过低，则缓冲能力差； 如果离子强度过高，会在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），由于离子氛与待分离分子的移动方向相反，它们之间产生了静电引力，因而引起电泳速度降低。 缓冲液的粘度 泳动速度与溶液黏度成反比关系 3. 电场强度 电场强度越大，电泳速度越快。 根据电场强度的大小，将电泳分为高压电泳和常压电泳： 前者电场强度为2-10V/厘米，后者为70-200V/厘米。用高压电泳分离样品需要的时间比常压电泳短。 电渗 当支持介质不是绝对惰性物质时，支持介质表面可能会存在一些带电基团，如滤纸表面通常有一些羧基，琼脂可能会含有一些硫酸基，而玻璃表面通常有Si-OH基团等等。这些基团电离后会使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子，在电场的作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动，这种现象就是电渗 液体在电场中，对于固体支持介质的相对移动，称为电渗现象。 电渗 如果电渗方向与待分离分子电泳方向相同，则加快电泳速度；如果相反，则降低电泳速度。 5. 支持介质的筛孔 在筛孔大的介质中泳动速度快。 四、电泳的分类 1、电泳按其分离的原理不同可分为： 自由界面电泳：是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。 区带电泳：电泳过程中，待分离的各组分在支持介质中被分离成许多条明显的区带。 2、区带电泳按支持介质的不同可分为： 纸电泳： 醋酸纤维素薄膜电泳： 淀粉凝胶电泳：孔径度可调性差，由于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低 琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 电泳的分类 聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高，分子筛效应很大。 毛细管电泳：分辨率好、灵敏度高、检测快捷 3、 按用途不同可分为： ⑴ 分析电泳；⑵ 制备电泳；⑶ 免疫电泳； 4、 按支持物的装置形式不同，可分为： ??? 1．平板式电泳 ??? 2．垂直板式电泳??? 3．垂直柱式电泳 第二节 琼脂糖凝胶电泳 一、基本原理 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。 通常情况下，多用于核酸类物质的分离、鉴定。 琼脂糖是从琼脂中提纯出来的 琼脂糖凝胶的制作：将干琼脂糖悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度是1％－3％ 加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。 琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径 决定DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素： 1、DNA分子的大小 DNA迁移距离与其分子量的对数成反比。 2、琼脂糖浓度 DNA电泳迁移率的对数和凝胶浓度线状相关。 3、DNA的构型