免疫沉淀实验.ppt

实验一免疫沉淀类反应 辽宁医学院附属一院检验科 王彩红 免疫沉淀反应：可溶性抗原与相应抗体在溶液或凝胶中接触形成肉眼可见的抗原抗体复合物沉淀称为免疫沉淀反应。 一、双向免疫扩散试验 指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散，彼此相遇，在浓度比例适当处形成沉淀线。 根据沉淀线的有无、形状和位置对抗原或抗体进行定性分析，也可用于抗体的半定量检测 本次实验利用此原理进行抗体效价的测定 试剂与器材 抗体：兔抗人全血清 抗原：人血清 10-15g/L 琼脂（以生理盐水配制） 载玻片、打孔器、微量进样器 37℃水浴箱 制板 取加热融化的盐水琼脂约4ml，均匀浇在水平放置的载玻片上，使成厚度约为1.5mm的琼脂板，待冷凝。 打孔 打梅花孔（如图），各孔间的距离为4-5mm。 倍比稀释抗体 （见下表） 加样 用微量加样器分别取抗原、抗体10ul加入各孔。中央孔加10ul抗原，周围6孔分别加不同稀释度的抗体。 温育 将玻片放在湿盒中，37℃温育24h，观察沉淀线。 在抗原和抗体孔之间会看到白色的沉淀线，将出现白色沉淀线的抗体最高稀释孔作为该抗体的效价。 应用 玻片要清洁，边缘无破损。 浇制琼脂板时要均匀、无气泡。 孔要打得圆整光滑，边缘不要破裂，底部勿与载玻片脱离。 加样时应尽量避免气泡或加到孔外，以保证结果的准确性。 反应时间要适宜，时间过长，沉淀线可解离而导 致假阴性、不出现或不清楚。 二、对流免疫电泳 对流免疫电泳是将双向免疫扩散和电泳相结合的一种技术。 在pH8.6的缓冲液中，抗原带负电荷，向正极移动；抗体在电渗作用下向负极移动。在两者相遇的最适比例处形成白色沉淀线。 抗原：人全血清 抗体：兔抗人全血清 1％琼脂：0.05mol/L pH8.6的巴比妥缓冲液配制 电泳槽、电泳仪、 载玻片、水浴箱、打孔器、微量加样器 制板 取已经融化的1%琼脂约4ml，加到水平放置的载玻片上，使成厚度约为1.5mm的琼脂板，待冷凝。 打孔 用打孔器打孔，孔径3mm，两孔间隔4-5mm。（如下图所示） 加样 用微量加样器分别取10vl抗原、抗体，按图加样。 电泳 将琼脂板置于电泳槽内（抗原端放阴极侧，抗体端放阳极侧），两端贴上用电泳液浸湿的纱布。通电，调整电压为4V/cm长或电流3-4mA/cm宽，电泳30min-1h。 结果判断 在黑色背景上方，用散射光多个角度观察，在对孔之间是否有白色沉淀线出现。 如果沉淀线不清晰，可将琼脂板放入湿盒于37℃保温数小时，可增强沉淀线的清晰度。 注意事项 加样时不要起气泡，勿溢出琼脂孔。 抗原、抗体的量应相近，如抗原量过多， 可造成假阴性结果，须通过稀释抗原加以解决。 电泳时电压不宜过高或过低，过高可能会将琼脂拉断；过低时沉淀线出现的时间会延长。 * 沉 淀 反 应 环状沉淀反应 絮状沉淀反应 琼脂扩散试验 单向扩散试验 ＋ 电 泳 技 术 火箭免疫电泳 对流免疫电泳 双向扩散试验 实验原理 A B C 实验步骤 1 25 25 25 25 25 50 抗人血清 25 25 25 25 25 生理盐水 6 5 4 3 2 1 结果判断 检测未知抗原或抗体 抗原性质分析 抗体效价滴定 抗原或抗体纯度鉴定 注意事项 实验原理 试剂和器材 实验步骤 + — Ag Ab 人血清 羊抗人血清 生理盐水 * * 沉淀线靠近抗原孔，提示抗体含量高；靠近抗体孔，提示抗原含量高。出现多条沉淀线，则说明抗原和抗体都不是单一成分。沉淀线弯向分子量大的一边，如相等，则为直线。抗体多为IgG，分子量约150000，据此可粗略估计未知抗原的分子量。两种受检抗原的性质可完全相同，部分相同或完全不同。