质粒DNA的小量快速提取(碱裂解法)..ppt.ppt

质粒DNA的小量快速提取（碱裂解法） ——施文桃 文力 何艾 许鹏飞 【实验目的及背景】 掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各主要试剂的作用。 质粒是染色体外的DNA分子，大小可为1kb到200kb。 大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。 其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。 * 质粒特点 质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。 质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体， 是细菌有性繁殖的性因子. * 质粒的分类 质粒按复制方式分为两种类型： 松弛型质粒 和 严紧型质粒 松弛型质粒 松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可达2000-3000拷贝。 严紧型质粒 严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白，质粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成抑制剂来增加。 * 分离质粒DNA方法 从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的 碱变性法； 煮沸法； SDS法； 羟基磷灰石层析法等 各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化。 * 【实验原理】 在碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA都发生变性，但质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当用酸性的高盐缓冲液将pH值中和至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型并溶解在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，缠结的染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，然后用酚-氯仿抽提，进一步纯化质粒DNA。上清液中的质粒DNA。上清液中的质粒DNA因不溶于70%乙醇，可在加入乙醇后通过离心得到质粒DNA沉淀。 * 碱裂解法 碱裂解法是较常用的质粒DNA提取方法.其优点是收获率高,适于多数的菌体,所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作. * 酚/氯仿抽提 可以通过酚、氯仿抽提去除残留的蛋白质.酚和氯仿都是蛋白质的变性剂,但酚的变性作用要远大于氯仿. 由于酚能溶解10%-15%的水,因此在使用前要用Tris溶液饱和.以免减少抽提过程中DNA溶液的损失. 水饱和酚的比重略比水重,碰到高浓度的盐溶液,离心后酚相会跑到上层,不利于含质粒的水相的回收;氯仿和酚可以互溶,加入氯仿后可以增加比重,使得酚/氯仿始终在下层,方便水相的回收. 由于酚与水很大的互溶性,用酚/氯仿抽提后会很少量的酚溶解到水相中,而酚会抑制很多酶反应(比如限制性酶切反应),用氯仿抽提一次将水相中的酚去除. * 乙醇沉淀DNA 回收后的水相含有足够多的盐,因此只要加入2倍体积的乙醇,在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来. 在pH为8左右的溶液中,DNA分子是带负电荷的,乙醇可以消除核酸的水化层,使带负电荷的磷酸基团暴露出来.Na离子能与这些带电基团结合,在沉淀形成的部位降低多核苷酸链之间的排斥作用,易于相互聚合而形成DNA钠盐沉淀.最常用的是盐是醋酸铵/氯化锂/氯化钠/醋酸钠. 沉淀体系如果盐浓度高,应在室温下沉淀,放到-20℃,时间一长反而会导致大量盐的沉淀. 为了去除随DNA沉淀的盐,可用70%的乙醇洗涤沉淀. * DNA的溶解 DNA沉淀经过70%乙醇洗涤后,在实验台上敞口放置一定时间,是残余乙醇挥发掉.当DNA衬垫仍有潮湿的时候,用适当缓冲液溶解便可溶的快速而且完全.完全干燥的DNA沉淀溶解缓慢且效率较低. 得到的质粒样品一般用含RNase(20ug/ml)的TE缓冲液进行溶解,不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的. * 【器材和试剂】 LB液体培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCL10g、去离子水950ml、待溶质完全后，用NaOH调节pH值至7.0（每升加5mol/LNaOH200μL),加入去离子水至总体积达1000mL,121℃,1010KPa高压蒸汽灭菌20min. 氨苄青霉素:100mg/mL 溶液Ｉ:50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/L Tris－HCl(pH=8.0) 葡萄糖：使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管子的底部，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。 * EDTA：是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，在溶液I中加入ED