分子生物学技术在中医药研究中的应用 课程总结.doc

《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案（7） 课程名称 分子生物学技术在中医药研究中的应用 总学时数 48 专业 中医基础和中医临床专业 内容 课程总结，介绍DDPCR、RACEPCR、测序、基因芯片等 时数 4 本次课目的要求 了解DDPCR、RACEPCR等技术和应用。 了解DNA样本测序处理、聚冰烯酰胺凝胶灌胶、上样、电泳、电泳后凝胶处理、放射自显影和读片技术。 了解基因芯片、cDNA Array原理技术和应用。 概要介绍必威体育精装版分子生物学技术及其在中医药研究中的应用和课程总结。把业已操作的实验及其意义串起来重复介绍，明确其目的意义。 本次课的重点难点 DDPCR、RACEPCR等关键技术与常见问题。 DNA样本测序处理、聚冰烯酰胺凝胶灌胶、上样、电泳、电泳后凝胶处理、 放射自显影和读片关键技术与常见问题。 了解基因芯片、cDNA Array原理、关键技术与常见问题。 本次课的应用教具 多媒体教学课件。 课程总结和部分新技术介绍 实验1 基因组DNA提取（方法类似于RNA的提取） 实验2 Southern blot（方法类似于Northern blot） 实验3 PCR PCR是Polymerase chain reaction的缩写，中文译作聚合酶链式反应。其特点是可以在几小时内方便、快捷地将微量DNA（含由微量RNA反转录成的cDNA）扩增达106倍，得到ug级的DNA！该技术发明于八十年代中期，到了八十年代末，由于引用了耐热DNA聚合酶，使这一技术得以蓬勃发展，成为分子生物学中应用最为广泛的技术之一，发挥着日益重要的作用。 由于其方便快捷，在中医药实验研究和临床检测中应用十分广泛。例如观察慢性炎症的活检组织中一些与肿瘤发生的基因是否存在突变，中医药治疗后防突变的作用如何；一些与肿瘤发生、转归、转移、凋亡等基因的表达如何，中医药的调控如何；探针的扩增等等。 原理 采用两段引物，分别与DNA两条链上各一段序列互补，位于模板DNA中拟扩增片段两条链的3端。加热使模板DNA变性解链，当反应的温度下降时，两引物分别与模板DNA两条链发生退火，然后两引物在DNA聚合酶的作用下延伸。在摩尔数大大过量的两段引物和4种dNTP的反应体中，位于两段引物间的DNA在反复的变性、退火、延伸的循环里，每一轮扩增的产物再一次充当下一轮扩增的模板，使其产物增加一倍。经过30-40个循环，目的DNA可由原来的1pg扩增到1ug。 1）引物退火与模版DNA结合；2）PCR第一链的延伸；3）再次变性解链后，上下游引物分别退火结合到原先和扩增了的模版上；4）PCR第二轮的延伸；5）再次变性解链；6）再次引物与扩增了的模版退火并延伸。 注意事项 PCR的常见问题主要有： 1．没有PCR产物。其主要可能有PCR反应的有关试剂缺乏，循环次数不够，退火温度太高，引物设计不好，模版不够，模版质量差，变性温度过高或过低，变性时间过长或过短，链延伸时间过短，Taq酶数量不够或质量不行，Mg++过低，dNTP过少，模版C/G过于丰富，等等。 2．PCR产物不纯，见多条条带产物。其主要可能有循环次数太多，退火温度过低，引物设计不合理，污染等。其中，引物设计不合理的可能性最大。 3．PCR产物前后一片，拖带。其主要可能有循环次数太多，退火温度太低，链延伸时间过长，模版质量差，模版过多，污染，Taq酶数量过多，Mg++过多，等等。 还有一些值得注意的问题： 4．关于引物。 （1）引物的长度。引物的长度要求不一，如模版是单一的载体和单一的插入片段，可以选用较短的插入片段两侧的载体序列作为引物，一些常用载体有现成的引物商品，可以购买。对于复杂的基因库，或反转录产物，为提高引物的特异性，建议采用较长的引物。具体可以参见RACE PCR介绍。 （2）引物的CG与AT的比例。可能的话，建议1:1左右。 （3）引物的计算机设计参见本书RTPCR介绍。 5．关于酶。一些实验反复失败，竟然会与酶的质量问题有关。因此，我们建议购买那些经常从事PCR实验的实验室所经常使用品牌及其供应商的PCR酶。 6．退火温度。通常按照检索到的文献或试剂盒提供的方法，可以确定退火温度。但是，时常会碰到两条引物的Tm值不一致，或PCR反复调整仍不见改善，此时可以考虑Touch Down PCR的方法，具体参见本书RACE PCR介绍。 7．CG丰富的DNA模版往往不容易扩增，对此，可以采用DMSO（DIMETHYL SULFOXIDE），用量为PCR反应总容积的1/10。比如将4ul的DMSO加入36ul的PCR反应液，使总容积达40ul。 8．MgCl2。通常PCR buffer中含有MgCl2，但是由于一些不清楚的原因，有时仍嫌不足，此时可以适当增加MgC