桑国俊 牛胚胎移植技术研究与应用[精品].ppt

* 附表 PBS冲卵液的配方（g/l） NaCl 8.00 KCl 0.20 CaCl2 0.10 KH2PO4 0.20 MgCl2·6H2O 0.10 Na2HPO4 1.15 丙酮酸钠 0.036 葡萄糖 1.00 牛血清蛋白(BSA) 3.00 青霉素 100iu/ml 链霉素 100μg/ml 双蒸水 1000ml * 3 胚胎质量评价 采集到的胚胎必须经过可用性测定，才能用于移植或冷冻保存 常用的方法有形态学鉴别法(根据胚胎形态，发育阶段)、短期培养法、荧光物质代谢法(利用二乙酰荧光素FDA)和死细胞荧光法(利用二味基苯吲哚)等 * 1-cell 2-cell 8-cell Morula Blastocyst Inner Cell Mass (ICM) Blastocoel Trophectoderm (TE) (A) (B) (C) (D) (E) * 牛胚胎发育特征 * 根据常规的形态学鉴别法可以把胚胎分为三级 A级(优良)胚胎轮廓清晰、颜色均匀、细胞密度良好、不见细胞外突和水泡等 B级(一般)胚胎轮廓清晰、颜色均匀、细胞密度良好、有突起细胞和水泡等，细胞变形率10-20% C级(较差)轮廓不清、颜色发黑、细胞数减少、外突细胞较多、变形率30-50% 通常鲜胚移植时，A级和B级胚均可采用，用于冷冻保存时，通常只选择A级胚，因为质量较差的胚胎抗冻性较差，因此不宜用于冷冻保存 * 4.胚 胎 保 存 ① 短期保存 活体保存 体外37℃保存 低温(0－10℃)保存 ② 长期保存(冷冻保存，供参考) 常规冷冻保存 快速冷冻保存 玻璃化冷冻保存 * 常规的程序降冷冻方法 以1-1.5M的甘油、乙二醇等小分子量的渗透性低温保护剂对胚胎进行平衡，脱水，然后装入细管内，程序冷冻仪按1-2℃/min的速率降温，在-7℃左右进行植冰(自动或人工)，然后继续以0.3-0.6℃/min的速率降温至-25 ～－35℃投入液氮(-196℃)长期保存。目前采用在此法基础上建立的一步冷冻法 解冻 按照冷冻程序逆向解冻，一步法可象细管冻精一样直接解冻后应用 * 快速冷冻方法 采用2-4M的甘油或乙二醇和0.25－0.5M的蔗糖或乳糖为防冻剂，平衡0.5－30min即置于液氮蒸气中快速降温2min，然后投入液氮 解冻 按照冷冻程序逆向解冻 玻璃化冷冻方法 它是利用高浓度的混合防冻剂的骤冷时形成一种非冰晶体的玻璃化状态,使胚胎免受损伤的方法。这种方法只须将装有胚胎的细管从室温直接投入液氮即可（冷冻液① 10%EG；② 0.5mol/l蔗糖PBS液；③ EFS30液） 解冻 按照冷冻程序逆向解冻 * 牛胚胎的冷冻保存技术 常 规 程 序 冷 冻 冷冻液 ① PBS＋3％FCS冲卵掖；② PBS+10%EG；③ PBS+12.5%蔗糖 一步 冷冻 方法 装管 ①10%EG第一液5min；②10%EG第二液10min；③四段法装管：SU-AIR-SU-AIR-EG+EMB-AIR-SU。装好后直接冷冻 冷冻 ①以1oC／min从室温降至-5.5- -7oC时植冰，在-7oC下停留10min；②植冰后以0.3oC／min的速率降至-30～－35oC，平衡10min后取出胚胎细管，直接投入液氮中保存 解冻 解冻温度38oC，解冻速率300-500oC／min 解冻液 PBS+20%FCS，一步法不用解冻液 玻 璃 化 冷 冻 冷冻液 ① 10%EG；② 0.5mol/l蔗糖PBS液；③ EFS30液 冷冻 方法 装管 ①10%EG中5min；②EFS30液中5min；