健康食品之免疫調節功能評估方法.doc

健康食品之免疫調節功能評估方法 壹、前言 健康食品的免疫調節功能評估，是針對包括非特異性及特異性免疫功能之評估。所謂非特異性免疫力主要包括如中性白血球(neutrophils)及單核球(monocytes)的吞噬能力或是自然殺手細胞的活性(natural killer activity)。而特異性免疫力主要是針對一些特定的抗原作進一步的評估，在老鼠身上可以利用外加注射一些特定的抗原，再進行抗原特異性免疫反應的評估，其中可以包括如特異性抗體的測定或是抗原特異性的T細胞增殖反應和細胞激素的研究。至於人體的抗原特異性免疫力的評估，則可能必須與疫苗注射來合併進行。同時，如果要評估免疫細胞的功能時，應該分別由質與量兩方面來加以分析。量方面主要是測定各種免疫細胞的數目，目前利用螢光流體計數儀可以容易地將免疫細胞正確地計算出。由於免疫功能在正常人或是為數不少的疾病都扮演著一個重要的關係，未來如果要更正確地評估健康食品在這些免疫疾病上的可能調節功能，也許需要另外建立動物模式或是經由人體的臨床試驗來加以評估這些功能。 貳、實驗方法 一、動物實驗 實驗動物：建議選用小鼠，常用的Balb/c或是B6小鼠皆可，6-8週大，雄鼠或雌鼠皆可，每組隻數為單一性別至少10隻。 非特異性免疫反應： 1.脾臟或是淋巴結細胞增殖反應： - T細胞建議使用如Con A或是Phytohaemagglutinin(PHA)的裂殖素(mitogen)，或是利用交叉連結(cross-linking)抗CD3抗體來刺激。 Lipopolysaccharide (LPS)來刺激。 -well plate, 再加入 Rosewell Park Memorial Institute 培養基(RPMI)或添加有 LPS, Con A, PHA 等細胞裂殖素的培養基。於 37℃ CO2 培養兩天後，加入 1 μCi/well 3H-thymidine，繼續培養 20 小時後，以 cell harvester 收集細胞於濾紙上，濾紙風乾後以閃爍計數儀測 3H-thymidine 含量，計算細胞增生能力。 (2) MTT 法： MTT的測定方法基本上是利用細胞本身的酵素對受質的作用，產生顏色的變化，再進一步測定其吸光值。如果細胞受到細胞裂殖素的刺激，增生越多，則活的細胞愈多，酵素的活性就會較高，可以測到較高的吸光值。利用此一原理，也可以來測定細胞的增殖反應，但是此種測定方法通常對附著性細胞的準確度較高，對懸浮性細胞則較不理想，進行本實驗時應特別注意。 (3) 螢光流體計數儀來測定DNA的染色： 利用螢光染色的方法來分析細胞是否受到刺激，細胞核內的DNA是否有任何變化，可以利用 Propidium iodide (PI) 及 bromodeoxyuridine (BrdU) 的方法來染色。PI可以在染色後直接利用螢光流體計數儀加以分析，但是 BrdU 的方法則需要再加上一個抗 BrdU 的單株抗體加上螢光，才能利用螢光流體計數儀來加以分析。為了進一步分析是那些細胞的DNA有增加的變化，可以同時對這些細胞進行表面標記的分析。如利用抗 CD3 及抗 B220 抗體先行染色，再將細胞加以固定，然後進行 DNA 的染色。對細胞的表面標記及細胞內的 DNA 螢光使用不同波長的螢光，以便能夠在儀器上能對這兩群不同的細胞進行分析。如果能夠達到此一目的，便能夠不需要將細胞分離出就可以知道是那些細胞受到活化。 2.抗體分泌實驗 血液中免疫球蛋白濃度：目前測定血清內免疫球蛋白的濃度，最常利用到的方法為 Radio immunodiffusion (RID) 法，此種方法在使用上較為方便，只要將血清放入培養孔中，靜置 24 至 48 小時後，再測量其直徑大小，與標準值對照，便可以算出免疫球蛋白濃度。除此外，也可以利用 sandwich-ELISA，或是生化的方法將免疫球蛋白的濃度計算出來，但是生化的方法可能必須在較具規模的醫學中心才能作得到。 3.細胞激素分泌實驗 將分離出的淋巴球以 2x106/ml 的濃度置於 24-well 的Plate中，利用已經定量過的 Con A 或抗 CD3 抗體來刺激這些淋巴球。經過 24 到 48 小時的培養後，將上層液離心下來，以測定其淋巴介質製造的量。在取得足夠檢體以前，可將其它檢體先保存在 -70℃，等到檢體足夠時再一起測試。淋巴介質的測定是利用sandwich-ELISA 法。先利用一個抗淋巴介質的抗體先覆蓋在 ELISA plate 上，在4℃ 靜置一晚。在進行實驗前先以 1% PBS-BSA 處理後清洗之。再將要處理的檢體加到 plate 上，置於室溫 2小時後加入