动物源性饲料中猪源性成分的定性PCR检测方法.doc

编 制 说 明 一、任务来源 根据国家认证认可监督管理委员会的标准制(修)订计划安排，行业标准《燕窝的分子生物学真伪鉴别方法》2007B149），归口国家认证认可监督管理委员会，由中国检验检疫科学研究院负责起草工作。 二、编制本标准的目的和意义 燕窝是由雨燕科金丝燕及同属类的唾液凝结而成的物质，是一种名贵的保健食品。由于燕窝的营养价值较高,消费者对其需求日益增长。而燕窝是一种稀缺资源，世界贸易统计每年收获的燕窝总重量只有大约2000吨。正是在这种供需矛盾和巨大经济利益的驱使下，燕窝市场的掺假掺杂现象十分普遍,造假材料主要包括银耳、猪皮、琼脂、果胶、蛋清等，使消费者蒙受损失。目前缺乏燕窝质量相关的检测标准，十分有必要开展燕窝产品真伪鉴别方法研究并进行标准化，以保证燕窝市场的规范化运行〔1，2〕。 三、编制原则 本标准的编写是按照GB/T1.1-2000《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则》的要求进行的。本标准是在“十一五支撑项目”《功能性食品有效成分检测和鉴伪技术的研究》的基础上制定的。期间参考了大量国内外相关文献，通过多次实验和反复论证，吸收借鉴国内外相关经验，在遵循标准科学性、实用性和可操作性的原则基础上，确定了燕窝产品真伪鉴定的实时荧光PCR和双向电泳检测方法标准。 四、国内外文献调研情况 目前燕窝的鉴定方法很多，如表面特征、溶涨性、泡沫、染色、灼烧等简单的物理方法，微观形态的显微观察方法，蛋白质含量、紫外吸收、氨基酸组成、唾液酸含量、多糖组分等仪器分析方法。但上述方法存在一些缺陷，例如燕窝是唾液腺的分泌物,不存在明显的组织细胞特征,因此显微鉴别的结果可靠性不高；燕窝理化鉴别的物质基础在于其粘蛋白,虽有一定的特异性,但由于伪品在制造过程中往往加入一定量的蛋清做粘合剂,故理化鉴别专属性不强；红外光谱法存在样品取样均匀性问题；气相色谱法是以寡糖链成分为分析基础,形成燕窝的单糖指纹图谱以作鉴别，但在生物合成过程,糖蛋白中的糖链是通过糖基转移酶从核苷酸糖将单糖顺次地装配到已形成的糖链受体上,最终生成的糖链结构不但决定于每个糖基转移酶的专一性,而且也受到肽链结构和形成异头键能力的影响,故糖链的合成过程不是模板化的,可以终止不同阶段,因而糖链结构普遍存在微不均一性。这种微不均一性会影响鉴别结果的可靠性〔1，2，3，4〕。 相比于上述方法，电泳鉴定是以燕窝所含水溶性蛋白质为分析基础,已经证明燕窝的蛋白质是燕窝药效的物质基础之一。因此,理论上电泳中蛋白质谱带的位置、显色的深浅可很好地反映燕窝的真伪和质量,但由于燕窝蛋白富含唾液酸,影响其电泳分离效果。本方法采用的双向电泳法，结合了等点聚焦和SDS垂直电泳技术，明显增强了蛋白质分离效果。另外，实时荧光PCR法已被广泛应用与物种鉴定，可用于燕窝制品中燕窝成分的快速检测。 五、主要技术内容 （一）材料与方法 1、样品种类及来源 4份燕窝样品（苏普官燕、云南白燕、瓜目官燕、瓜曼官燕）由浙江杭州胡庆余堂保健品有限公司提供，另有5份燕窝样品（白燕盏）由广东检验检疫局技术中心提供。葱、大豆、胡萝卜、黄瓜、鸡、鹿、米、木瓜、牛、芹菜、土豆、兔、西瓜、鳕鱼、鸭、羊、玉米、猪、银耳等19份样品购自市场。 2、主要试剂 主要仪器设备 表1 检测用引物 名称 序列 目的基因 Cfib5’端引物 Cfib3’端引物 5’- TGAATTGAGCCTGTCGTCTG -3’ 5’-TGCTCCATAGCCAAACAAGA-3’ 纤维蛋白原基因 NA5’端引物 NA3’端引物 5’- ATTCGAAAAATCCTGGCCTT -3’ 5’- CATTGGGGTTTTTGTTCAGG -3’ NADH脱氢酶 表2实时荧光定性PCR反应循环参数 作用 时间/s 温度/℃ 去污染 120 50 活化DNA合成酶和预变性 600 95 PCR（40个循环） 变性 15 95 延伸 60 60 变性反应（1个循环） 变性 15 95 复性 20 60 变性 15 95 最后两个步骤之间升温时间设为最大值 6、蛋白质提取 将样品充分研磨，称取500 mg于50 ml离心管中，加10 ml水，4℃放置24 h，1000 ×g离心10分钟，吸取800μL上清于1.5ml离心管中，共6管。真空离心浓缩3　h，液体缩减至约200μL。使用蛋白纯化试剂盒进行蛋白除盐，冷冻干燥后用300μL上样缓冲液溶解，具体操作是通过超声破碎辅助，用上样缓冲液依次溶解所有6管蛋白。12000×g离心5分钟，取上清进行等点聚焦。每个样品制备两份蛋白上清，同时进行等电聚焦和SDS。 7、等电聚焦 将IGP胶条于室温放置10分钟，沿着聚焦盘中槽的边缘从左至右线性加入蛋白样品。在槽两端1cm左右不要加样，中间样品液保持连