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CRISPR-Cas 技术;CONTENTS;CRISPR/Cas9系统是一特殊的DNA重复序列家族，又命名为成簇的、规律间隔的、短回文、重复序列，是目前用于基因敲除、点突变、基因插入、基因修复等基因编辑方面的新方法。 CRISPR/Cass系统是从细菌和古生菌内发现的，它参与细菌的免疫过程，抵挡外源遗传物质的侵袭，是一种后天获得的防御系统。 以往的基因编辑技术（ZFN/TALEN）一次只能编辑一个基因，并且耗时耗力。 CRISPR/Cas9 技术最大的优势就在于一次可以编辑很多个基因位点，只需设计多个不同的 g RNA，它可以介导 Cas9 核酸酶进行多靶点基因编辑 。 CRISPR/Cas9 技术可以通过核酸之间的相互识别，防止 DNA 甲基化对基因编辑的干扰。编辑效率显著高于ZFN/和ALEN。且不需要反复设计核算内切酶载体，操作简单。;1，CRISPR/Cas系统的由来; ;2 CRISPR/Cas 系统的分类;CRISPR-Cas系统包括不连续的重复序列（Repeats）、间隔序列（Spacers）间隔排列成CRISPR簇、前导序列（L）和编码Cas酶的基因、tracrRNA基因。;Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA的引导下切割靶位点， Cas9 具有 HNH 和 Ruv C 两结构域，都可以切割 DNA，其中 HNH 结构域切割互补的 DNA 链，Ruv C 切割非互补的 DNA 链。Cas9切割双链时无特异性，可作用于任何基因。;crRNA与tracrRNA碱基互补配对结合成gRNA，此复合物能引导核酸酶Cas9 蛋白切割与crRNA配对的双链DNA。;CRISPR间隔区的获得;1 CRISPR 间隔区的获得;2 crRNA的 表达和成熟;3 外源基因的切割;在真核生物中DSB （DNA双链切口）可被两种不同的机体自身修复机制修复DSB——非同源性末端连接（NHEJ）和同源重组（ HDR）进行修复。NHEJ能够高效地引入不同长度的插入或缺失突变（indel），产生由于移码突变而导致的基因功能受损，多用于细胞或动物模型中的基因敲除、功能基因组的筛查、转录调控和基因沉默的研究；HDR以DNA结构的同源性为基础，修复会带入特定位点的突变或在外源DNA供体模板存在下对靶点形成可预测的插入.此外还有一种微生物学介导的末端连接，这种在实验中比较少应用。 除了DSB，实验时也能利用Cas9突变的“切口酶”形成单链切口（Nick），可通过同源重组（ HDR）进行修复，以完整的链为模???修复缺口。 ;基因敲出：如向受精卵中注射Cas9mRNA和sgRNA、构建gRNA-Cas质粒结合非同源重组进行基因的敲除。 构建sgRNA文库进行基因组筛查和药物靶点的鉴定。 基因表达调控：改造成转录激活因子、转录抑制因子等调节蛋白对基因表达进行调控。如使Cas9两个活性位点突变形成dCas9，dCas9不切割DNA，而是引导抑制因子或转录因子的结合到靶位点上，从而达到抑制基因的表达或激活基因的表达。目标位置可以是启动子区域、调控区域或早期编码区域。;脱靶现象是基因编辑实验的资格重要问题，CRISPR/Cas的脱靶受到sgRNA、PAM、Cas9等的影响。实验时可以通过设计优化的sgRNA、控制Cas9-sgRNA的用量、改造Cas9、选着合适的PAM系列和适中的酶浓度等方法降低脱靶率。 ;六、实验设计;实验思路;用CRISPR-Cas9技术筛选跟肿 瘤转移密切相关的基因;实验过程;实验过程;实验过程;实验过程;