医学--抗肿瘤药效评价.ppt

抗肿瘤药的药效学研究;抗肿瘤药的药效学研究;1. 细胞毒性药的药效学研究; MTT法的基本原理： 四氮唑[MTT,3-(4,5-dimethylibiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide]是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与NADP相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲[月替] (formazan)，而死的细胞则无此功能。用二甲基亚讽(DMSO)溶解甲[月替]后，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率。; 操作步骤: 1．选用对数生长期的贴壁肿瘤细胞，用胰酶消化后，用含10％小牛血清的RPMI l640 培养基配成5000个／ml的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔接种200μl，37℃，5％ CO2 培养24h 2. 实验组换新的含不同浓度被测样品的培养基，对照组则换含等体积溶剂的培养基， 每组设3~5平行孔，37℃，5％CO2 培养4~5 d;3．弃去上清液，每孔加入200 μl新鲜配制的含0.2mg／ml MTT的无血清培养基．37℃继续培养4h。小心弃上清，并加入200 μl DMSO，用微型超声振荡器混匀后，在酶标仪上以试验波长为570nm，参比波长为450nm测定光密度值。;结果评定: 按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率： 肿瘤细胞生长抑制率％＝(1-OD实验/OD对照) ×100％ 以同一样品的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制率作图可得到剂量反应曲线，从中求出样品的半数杀伤浓度IC50。合成化合物或植物提取纯品的IC50＜10 μg／m1或植物粗提物的IC50＜20 μg／m1时，则判断样品在体外对肿瘤细胞有杀伤作用。;染料排斥试验的基本原理： 活细胞有排斥某些染料如伊红、台盼蓝、苯胺黑等的能力，而死细胞由于膜完整性的破坏，可被着色。因此培养的肿瘤细胞中加入这些染料，一定时间后，对着色和未着色的细胞进行计数，即可算出被杀死的细胞比例。; 生长曲线法的基本原理： 在最适条件下，肿瘤细胞在培养液中呈指数生长，如取细胞数的对数与培养时间作图可得一条直线，故称此时为对数生长期。随着细胞密度不断增高，由于代谢产物的积聚及营养物的消耗，细胞生长逐渐减慢以致停止，此时称高坪期或稳定期。因此药物对细胞生长的影响可通过生长曲线反映出来。;集落形成法的基本原理： 克隆原细胞具有持续增殖能力，当单个细胞分裂6代或6代以上时，其后代所组成的群体(集落)便含50个以上细胞。通过集落计数可对克隆原细胞作定量分 析。它反映了单个细胞的增殖潜力，故能较灵敏地测定抗癌药的活性，日前被认为是一种较理想的检测方法。常用的集落形成法可分为贴壁法及半固体培养法两种。;SRB法的基本原理： SRB(sulforhodamine B)是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于水。 SRB可与生物大分子中的碱性氨基酸结合。其在515nm波长的OD读数与细胞数呈良好的线性关系。故可用作细胞数的定量。MTT法的一个缺点是OD值可随放置时间而变，而SRB法无此现象。因此更适用于进行大规模的试验。;动物移植性肿瘤实验法;其优点是 肿瘤生长均匀，个体差异小。 接种成功率高，可达100％。 对宿主的影响也类似，易于客观判断疗效。 动物移植性肿瘤可在同种或同品系动物中连续移植，长期保留，以供实验用。实验周期较短。;缺点： 假阳性问题：由于动物瘤株恶性度高，生长迅速，对药物的敏感性比人类自发的肿瘤高得多，且动物肿瘤的生物学特点与人癌有较大的差距，因此对动物肿瘤生长有抑制作用的药物对人癌不一定有效。 假阴性问题：一种药物未必对各种类型的动物移植性肿瘤都有效，选择某一瘤株供筛选都可能漏筛药物。; 对于假阳性问题，现在有用人的实体瘤细胞接种在裸鼠上，进行实验来加以克服。;几种常用的动物移植性肿瘤; 白血病L1210是在1948年用甲基胆蒽DBA/2小鼠诱发所得，它是一种能在DBA/2小鼠及其杂交一代BDF1和CDF1小鼠上生长的淋巴性白血病，是动物实验治疗中最为常用的一种肿瘤模型，在小鼠白血病1210的实验治疗中，将1× 105个腹水细胞接种在BDFl或CDFl小鼠腹腔内。在接种后24h开始给药治疗，实验结束后比较对照组与实验组的小鼠平均存活时间，即可判断药物的疗效。; Walker—256瘤是1928年在一个怀孕大白鼠的乳腺部位自发产生。接种在皮下或肌肉内成为实体瘤，接种在腹腔则成为腹水瘤。在接种后第3d开始给药治疗，实验结束后比较对照组与实验组的瘤重或大鼠平均存活时间，即可判断药物的疗效。; Lewis肺癌是1951年在一个C57BL／6小鼠上发现的自发性