基因工程3-1 基因操作的工具酶教材课程.ppt

第三章 基因操作的工具酶;3.1 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） “限制性核酸内切酶” ：是一类能够识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并将DNA双链结构切开的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化到的。 ? 限制性核酸内切酶：切割DNA，降解入侵细胞的外源DNA，提供了特殊的重组机会和保卫种的稳定。 ? DNA 甲 基 化 酶：修饰DNA（modification），具有种属专一性，通常只修饰宿主本身的DNA，保护其免受降解。 限制酶和甲基化酶对DNA底物有相同的识别序列。 ;3.1.1 分类和命名 分类 ： 三类酶均能识别DNA分子中特定的核苷酸序列 ? I 型 酶：既有内切酶活性，又有甲基化酶活性（限制-修饰功能）；对DNA序列的切割是随机的 ? II 型酶：核酸内切酶活性和甲基化酶活性是分开的；切割位点固定，就在特异序列处（在分子克隆中十分有用） ? III型酶：也具有限制-修饰功能；切割位点距特异序列3’-端有24~26 bp的误差;命名 ： (1) 取属名的第一个字母（大写）、种名的前两个字母（小写）组成3个字母的略语，表示产生菌的物种名称 (2) 用罗马数字表示分离到的酶的编号，有时在字母和罗马数字之间还加上一个字母表示菌株的名称（也可以没有） e.g.：从大肠杆菌RY 13菌株（Escherichia coli RY13）中分离到的第一个限制性核酸内切酶，称为EcoR I ;3.1.2 II型限制性核酸内切酶的基本特征 基本特征： (1) 作用于双链DNA分子 (2) 能够识别由4~8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列——识别序列 或 靶序列 靶序列具有回文结构，也称双重旋转对称结构 如： 或 N代表任意一种核苷酸;EcoR I识别的靶序列为： ;(3) 切割靶序列形成粘性末端或平末端 ? 两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，结果形成具有平末端的DNA片段。 如Sma I识别的靶序列为： 切割后形成： ;? 两条链上的断裂位置是交错的，但对称地围绕着一个对称轴排列，结果形成具有粘性末端的DNA片段。 “粘性末端”（cohesive end）：是指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化。粘性末端有两种： 如EcoR I切割后形成： 其单链末端向5’端延伸，称“5’端延伸的粘性末端”。 ; 假定限制位点沿着DNA分子的分布是随机的，则平均每44（即256）个核苷酸出现一个识别4个核苷酸的限制酶（如Sau 3A或Mbo I）的靶序列，而识别6个核苷酸的限制酶（如EcoR I）的靶序列每46（即4096）个核苷酸出现一次。从遗传工程的角度考虑，选用识别序列较长的限制酶可以得到较长的DNA片段。 ;?“同裂酶 ”（isoschizomer）：来源不同，但可识别同样的DNA靶序列，产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶，即异源同功酶。 如Sma I和Xma I： 如Mbo I和Sau 3A： ;?“同尾酶 ”（isocaudamer）：来源不同，识别的靶序列也不同，但都产生出相同的粘性末端的一类限制性核酸内切酶。 如 BamH I G ?GATCC Bcl I T ?GATCA Bgl II A ?GATCT Sau 3A ?GATC Xho II U ?GATCY （U：嘌呤，Y：嘧啶） 都形成由GATC四个核苷酸组成的粘性末端。 ; 由同尾酶所产生的DNA片段，能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来，所以在基因操作中很有用处。但必须注意，由两种同尾酶消化而产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构不能再被原来的任何一种同尾酶所识别。 如： ; 限制性核酸内切酶识别的靶序列同DNA的来源无关，原则上任何不同来源的DNA，经过适当限制酶的处理之后，可以通过其粘性末端或平末端连接起来。这种特性是重组DNA的重要基础之一。 ;条件 ; ? 一个限制性核酸内切酶活力单位定义为： 在建议使用的缓冲液及温度下，在20 ?L反应液中反应1 h，使1 ?g DNA完全消化所需要的酶量。 ;3.1.3.2 反应的操作步骤