基因的克隆教学幻灯片.ppt

云南大学 基因文库的建立以及筛选 用前述方法将重组子转入宿主细胞内（如大肠杆菌等） cDNA重组克隆的筛选： 制备杂交探针，进行探针原位杂交法； 差异杂交筛选：获得某些在特定组织、细胞中或特定时序表达的目的基因； 丰度高或中等的标准差示杂交筛选差示杂交.ppt； 低丰度的cDNA：改进差示方法改进差示杂交.ppt SSH( Suppression subtractive hybridization) 基因文库的建立以及筛选 应用表达文库来分离目的基因 １．概念：表达文库是指将蛋白质编码基因（如cDNA)插入合适的表达载体中，通过筛选相应基因的蛋白质表达产物达到分离目的基因的要求。 ２．表达文库的构建：以真核生物的表达文库来说明构建策略 以cDNA文库相同的方法完成从mRNA到双链cDNA的转变； 双链cDNA与载体连接：表达文库不仅要使外源cDNA插入到表达载体启动子下游，置于启动子调控下，另一个关键问题是要使cDNA以正确的取向和编码框架插入表达载体才能确保产生正确的蛋白质。为此，最简单实用的方法就是在cDNA分子两端都装上相同的寡核苷酸衔接片段，酶切处理cDNA与载体后，进行连接，这样的结果就是cDNA可以以任何一种取向插入到表达载体上。因此cDNA可以按照两种方向插入，每一种方向可能有三种开放性阅读框架。所以建库和筛库时注意平均来讲每６个克隆才可能筛选到一个相应的正确蛋白质。 基因文库的建立以及筛选 3．基因文库的建立以及筛选 利用目的基因编码蛋白质的抗体(目标蛋白质的抗体),大致方法如下:文库铺板－硝酸纤维膜固相转移（原位）－处理滤膜，使转移到硝酸纤维膜的每个克隆中的蛋白质暴露出来－目标蛋白质的一抗与膜杂交－漂洗未结合的一抗－已标记的二抗杂交－放射性自显影或与底物作用，显示阳性克隆的位置－挑选阳性克隆，并对重组子进行测序；抗体筛选表达文库.ppt 测定蛋白质功能：在一定条件下以某种与目标蛋白质具有生物学相关性（如能够与目标蛋白直接结合）蛋白作为筛选探针，从表达文库中挑选目的基因； 用同位素标记能够与目标蛋白结合的ＤＮＡ片段作为筛库探针，从而筛选与ＤＮＡ片段结合的目标蛋白（如转录、翻译调控因子）。这种方法在真核基因表达调控研究中十分有效，尤其是分离与启动子元件特异性结合的转录因子的编码基因。 基因文库的建立以及筛选 酵母双杂交（yeast-two hybridization) 简介：酵母双杂交是90年代初期由纽约州立大学的S. Fields及合作者建立的一种敏感的体内鉴定基因的方法。它可以用来分离与一种已知蛋白质相互作用的蛋白质的编码基因； 原理：真核生物TF (transcript factor)是由２个结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain)组成，即结合结构域(binding domain)与激活结构域(active domain)。结合结构域可以和被调控基因上游的特定序列结合（顺式作用元件）；而激活结构域则通过与其它一些转录因子的共同作用，激活下游基因转录。但是如果利用ＤＮＡ重组技术使ＴＦ的这２个结构域人为分开，并且不能自主重新结合到一起，那么它们就无法行使激活转录的作用。但是如果将这２个结构域都同时嵌合表达，即ＢＤ表达一种已知蛋白质，ＡＤ编码基因与某些组织的cDNA融合，使ＡＤ与另一种蛋白融合表达。此时如果ＢＤ表达的已知蛋白Ｘ与ＡＤ融合表达的Ｙ蛋白可以相互结合，那么就会重新使ＡＤ与ＢＤ结合到一起，形成完整的ＴＦ，从而激活下游基因的转录。 基因文库的建立以及筛选 酵母双杂交基本过程： 宿主细胞株：将酿酒酵母中GAL4编码基因删除掉，使之成为GAL4?菌株。宿主细胞株中有四套报告基因：TRP-；LEU-；HIS-；?-半乳糖苷酶- 构建大肠杆菌以及酿酒酵母的穿梭质粒： 例如，酵母双杂交中的一套质粒载体： pGBT9　编码GAL4的BD，又称为DNA-BD质粒载体，在载体的多克隆位点可以插入诱饵蛋白（即已知蛋白质）的编码基因，从而表达BD-X嵌合蛋白； pGAD424 用来构建cDNA表达文库专用载体,表达AD-Y嵌合蛋白。 BD-X、AD-Y表达后经核定位信号定位，转运进入宿主酵母的细胞核内，如果在一个宿主菌中，同时转入了pGBT9 、pGAD424，并且融合的X-Y相互作用，那么宿主菌株就能在TRP-；LEU-；HIS-三缺平板上生长（营养缺陷筛选），同时还可以检测到?-半乳糖苷酶的活性。 PCR及其应用 PCR的简介：RCR即聚合酶链式反应(polyerase chain reaction)是美国Cetus公司人类遗传学研究室科学家K.B.Mullis于1983年发明的一种体外