外源基因在植物细胞中的表达教学文稿.ppt

外源基因在植物细胞中的表达; 基因的体外重组和表达体系最早是利用大肠杆菌作为宿主，以后逐渐发展到真核生物细胞作为宿主，如酵母、植物细胞和动物细胞等。以植物细胞作为转化受体，不仅能把一些植物基因或DNA片段作为外源基因转化到受体植物，而且能把动物或微生物中存在的基因转化并整合到植物基因组中，使其在植物细胞中表达。; 外源基因在真核生物细胞中的表达，对于分子生物学理论研究，对真核生物基因表达调控的探讨提供了其他试验方法难以达到的有力手段。 外源基因如何才能转入真核细胞？又如何能从数量庞大的细胞群体中筛选出遗传转化的细胞？又是如何对转化的真核生物进行鉴定？;;（1）新霉素磷酸转移酶（氨基葡萄糖苷磷酸转移酶，neomycin phosphotransferase Ⅱ, NptⅡ） Npt Ⅱ 基因表达产生的酶可催化许多氨基葡萄糖苷类抗生素（如新霉素，庆大霉素，卡那霉素和G-418）的O-磷酸化，使抗生素失去对细胞的毒性，这是由于磷酸化的抗生素不能与植物细胞叶绿体和线粒体中的核糖体30S亚基结合，进一步影响70S起始复合体合成，干扰线粒体和叶绿体的蛋白质生物合成，使植物细胞最终死亡，因此，与外源基因结合的Npt基因转化细胞后，就可在含有抗生素的培养基上存活下来。 ;（2）二氢叶酸还原酶基因（dihydrofolate reductase，Dhfr） 二氢叶酸还原酶为真核细胞核苷酸合成所必需，而氨甲喋呤（mathotrexate，MTX）作为竞争性抑制剂抑制Dhfr酶的活性，当培养基中存在MTX时，则由于植物细胞中不能合成四氢叶酸而抑制生长。 有一种Dhfr的突变酶，它与氨甲喋呤的亲和力较正常酶降低260倍，突变酶不为MTX所抑制，抗MTX，将编码该酶的基因与CaMV35S启动子拼接后导入植物细胞，则转化植物细胞能在含有MTX的培养基上正常生长。相反，未转化植物细胞，其Dhfr对培养基中的MTX十分敏感，而不能存活。;（3）潮霉素磷酸转移酶（hpt） 潮霉素B作为一种抗生素对大多数植物均有毒性，但当潮霉素B被细菌中分离到的潮霉素磷酸转移酶催化而磷酸化时，其毒性丧失。利用这一特性，可以把hpt作为选择标记，即把htp基因和适合植物的强启动子构建成嵌合基因，??化受体植物，转化有htp基因的植物细胞能表达出潮霉素磷酸转移酶，使培养基中的潮霉素B磷酸化而失去毒性，反之，未转化该基因的细胞则被潮霉素毒害致死。 除了以上3种常用的选择标记基因之外，还有庆大霉素抗性基因，链霉素抗性基因等抗生素类选择标记，此后，又发展出非抗生素选择标记，如抗草甘膦类除草剂基因等。;2. 报告基因 报告基因是指用于检测组装的嵌合基因在导入细胞后是否具有功能的一种指示基因，它通常是编码在离体条件下易于检测的酶。 具体是将报告基因连接在待研究的目的基因的启动子的下游，其后再连接真核生物的终止信号，然后将构建的融合基因转化受体细胞，组织，获得转基因植株。在转基因植株生长发育的不同阶段，不同器官和组织乃至细胞，分析其中的报告基因产物-酶活性，从而了解该目的基因在何时、何处表达。 作为报告基因，其表达产物及产物的类似功能在未转化细胞中原本并不存在。; 原位组织化学定位应用于对稳定转化植物进行Gus融合基因时空表达模式的精确分析，方法是用X-gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚-β–葡糖醛酸，5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronic acid）作为底物，把待检测材料浸泡在含有底物的缓冲液中保温，在组织、细胞、原生质体被Gus转化的部位，Gus酶切割葡萄糖醛酸部分，产生无色的吲哚氧基中间产物，随后经氧化二聚作用形成5，5-二溴-4，4-二氯靛蓝的蓝色沉淀，经显微镜镜检，观察Gus活性部位，继而了解嵌合基因表达的组织化学定位。 该方法检测要注意排除假阳性存在的可能，有人对52中植物的内源Gus活性进行测定，发现在营养生长阶段没有内源Gus活性，而在繁殖器官如胚、胚乳、果实种子、种皮中均有明显的内源活性，而随着种子萌发又逐渐消失。 ;;;（2）氯霉素乙酰转移酶（ chloroamphenicol acetyltransferase，Cat） Cat基因来自细菌转座子Tn9，它编码氯霉素乙酰转移酶，以氯霉素为底物，使氯霉素乙酰化而先后生成3-乙酰氯霉素、1-乙酰氯霉素和1.3-二乙酰氯霉素。乙酰化的氯霉素不再对植物细胞产生毒性，故可作为选择标记。乙酰化反应产物采用薄层层析法分离，放射自显影检测各种乙酰化产物在层析位置的放射强度。 ;（3）荧光素酶基因（luciferase gene） 多取自萤火