微生物蛋白的提取和分离纯化知识讲稿.ppt

凝胶过滤层析的操作过程 1. 凝胶的选择 2. 装柱 3. 平衡（equilibrium) 4. 上样(loading) 5. 洗脱(elution) 6. 凝胶再生和保养 平衡缓冲液应与洗脱缓冲液相同 缓冲液种类、pH、离子强度和添加剂的选择应根据溶液与基质的相互作用、可溶性和样品的生化性质、以及后续操作的要求等选择。使用前通过0.45μm的膜过滤，可防止不溶性小颗粒堵塞柱子。 平衡体积至少为5倍床体积。 样品集中上样后，加洗脱液，防止返混 洗脱液成份应与膨胀胶和平衡时所用的液体相同 层析结果见图，分别收集峰，测定酶活，其中A峰活性最高，占上样总活性的85.14%，因此收集峰A，进行下一步层析。 层析结果见图，采用步进式洗脱，收集各个峰，测定酶活力。其中峰b酶活最高，占上样总活力的8.534%，因此收集峰b，浓缩后进行下一步层析。 发现峰A酶活最高，占总活活力的47.44%， 通过SDS一PAGE检测显示为单带。 析结果见图，层析图表明样品仅有一个单峰，结合SDS结果，可以证明贵州绿僵菌AS3.4608所产壳聚糖酶是单亚基蛋白。 在蛋白质纯化的起始阶段，合适的粗分离手段能大大降低后续操作的难度。在传统的粗分离方法中，实验室一般采用盐析(如硫酸铵)分段沉淀，使用该法蛋白质不易失活，但是操作体积较大，后处理麻烦，不能直接进行离子交换层析，需要进行脱盐处理(如透析或小孔径分子筛层析)，不适宜工业生产。工业上一般采用有机溶剂(如丙酮、乙醇)沉淀，该法分辨率较高，沉淀速度快，能够起到浓缩蛋白质溶液的目的，且能够降低盐浓度。但是该法易使蛋白质失活，样品活力损失较大。 目前还有一种粗沉淀蛋白质的方法是采用如EPG等高分子物质沉淀蛋白质，高分子溶液能够维持蛋白质构像，使蛋白质不易变性。但是一般使用高分子沉淀蛋白质分辨率较低，不适合采用分级沉淀的方法来达到粗分离的目的，而且沉淀蛋白质所需浓度的高分子溶液(如30%的PEG一6000)表观粘度一般较大，给分离沉淀操作带来不便。 本研究向粗酶液中加入PEG6000至终浓度为5%，可以沉淀部分杂蛋白，由于PEG的絮凝作用，可以使难以除去的小颖粒都聚集在一起自然沉降下来，这一点通过加入PEG后粗酶液明显分层且上清液很澄清即可看出:另一方面，PEG能够在丙酮沉淀过程中保护蛋白质，同时PEG能降低溶液的冰点，因而可以将蛋白质溶液放入一20℃中预冻而不会结冰，在加入冷丙酮沉淀蛋白的过程中可以进一步降低沉淀时的温度，减小因为蛋白质变性带来的活性损失。由于PEG溶于丙酮，大多数PEG通过离心随上清液除去，余下留在沉淀中的少量EPG也可以通过离子交换层析除去。由于提取液中的盐离子浓度较低，粗分离中也没有引入高盐浓度的溶液，因此沉淀蛋白质溶解后可以直接进行离子交换层析，而不需要脱盐。 微生物中蛋白的分离纯化 用途: 药物——多肽 饲料——菌蛋白 工业——酶 单细胞蛋白具有较门的营养价值。茵体中蛋白质可达40、60％，其中氨基酸组份齐全，生物效价较高，相当于酪蛋白，为70左右，而且赖氨酸等必需氨基酸含量较高，还具有丰富的维生素，可以作为维生案的补给品。 按其所发挥的功能把小肽分为两大类,即功能性小肽和营养性小肽。功能性小肽指能参与调节动物的某些生理活动或具有某些特殊作用的小肽,如抗菌肽、免疫肽、抗氧化肽、激素肽、表皮生长因子等。营养性小肽是指不具有特殊生理调节功能,只为蛋白质合成提供氮架的小肽。 目前，生物界已发现的酶有数千种，用微生物发酵法生产的酶有上百种。工业化生产的酶制剂，按用途不同可分为工业用酶和医药用酶两大类，前者一般不需纯制品，而后者要求的纯度较高，其价格是前者的数千倍至数百万倍。由微生物生产的工业用酶制剂主要有糖化酶、淀粉酶、转化酶、异构酶、半乳糖酶、纤维素酶、蛋白酶等，医药用酶主要有蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、核酸酶、脂肪酶、尿激酶、链檄酶、天冬酰胶酶超氧化物歧化酶、溶菌酶、血溶栓酶等等 蛋白质的分离纯化步骤 (1)生物组织的机械破碎。 (2)抽提：根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提。 水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提， 酸性蛋白用稀碱性溶液抽提， 脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。 (3)粗提: 用离心法除去固体杂质后，可通过沉淀法、膜分离法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。 (4)精制：可用层析法、电泳法进行精制。 (5)成品加工：测定蛋白质的性质并干燥成成品。 根据所需的目的蛋白制定蛋白提取和纯化的策略和步骤 一般的预处理：过滤（工业生产）和离心（实验室研究） 根据过滤机理的不同，过滤操作可分为澄清过滤（适合固体含量0.1g/100ml、 颗粒直径5~100μm ）和滤饼过滤（适合固体含量0.1g/100ml ）两种。 过滤操作是借助于过滤介质，在一定的