研究生实验三重组质粒dna提取、双酶切鉴定 课件.ppt

质粒DNA的制备限制性内切酶切割重组质粒;基因克隆;基因工程;基因克隆示意图; 基因载体 基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)柯斯质粒。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。 ;实验内容;实验目的;一.质粒DNA的提取;1.1 质粒的定义 质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。 在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。 ;;(2) 开环DNA (open circular DNA, OC DNA) 如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。;(3) 线状DNA (linear DNA, L DNA): 如果两条链均断开，即为线状DNA。 电泳时，三者泳动速度大小关系（？？？） ;最快;1.3 质粒DNA的基本特征： (1) 自主复制性：能独立于染色体DNA外自主复制； (2) 可扩增性：严紧型复制-复制1-5个拷贝 松弛型复制-复制数十个拷贝； (3) 可转移性：通过细菌结合作用从一个宿主细胞转移到另一个宿主细胞； (4) 不相容性：具有相似复制子结构特征的两种不同质粒不能稳定地存在于同一受体细胞内。 ;1.4 理想的克隆载体： (1) 分子质量小、多拷贝、松弛控制型； (2) 具有多种常用的限制酶的单切点； (3) 能插入较大的外源DNA片段； (4) 具有容易操作的检测表型。 ;1.4 提取质粒DNA的目的与意义： 基因载体/基因克隆/基因工程;2.1 提取质粒DNA的常规方法 (1)SDS碱裂解法 (2)煮沸法 (3) high pure plasmid isolation kit等。 但原理相似，都是利用宿主染色体DNA和质粒DNA的差异来分离的： ★ 宿主菌染色体DNA通常比质粒DNA要大得多 ★ 纯化分离的宿主菌DNA多为线性分子，而质粒 DNA呈闭合环的形式。 ;2.2 分离纯化质粒DNA的主要步骤;2.3 核酸分离纯化的总原则：;3. SDS-碱裂解法提取Puc119-U6重组质粒DNA 3.1 实验原理：;3.2 主要试剂及作用; 溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与 NaOH 组成(裂解、变性) ① SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白???分子结合使之 变性（裂解细胞和蛋白质变性作用） ② NaOH（PH12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用） ;溶液III：HAC(乙酸)和 KAC(乙酸钾)组成的高盐溶液 (复性，分离) ①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。 ②KAC会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成 沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS 复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。; 3.3 实验步骤;二、限制性内切酶切割重组质粒;1.3 作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。;2 BamHI 、HindⅢ酶切质粒及鉴定;;2.2 实验材料: (1)重组质粒; (2)BamHI 、Hind Ⅲ限制性内切酶; (3)反应缓冲液。;2.3 实验步骤 (1)建立反应体系 (2)酶切反应（温育12h） (3)电泳鉴定（下次实验课内容）;2.4 双酶切体系 质粒DNA 10μl 10×M buffer 2μl BamHⅠ 1μl HindⅢ 1μl ddH2O 6μl ;思考题？