技术人员培训课件：PCR基因扩增.ppt

乙肝病毒（HBV）PCR检测 试剂盒组成 DNA提取液：裂解病毒蛋白外壳，使病毒DNA游离 PCR反应管：含有扩增HBV特异DNA片段的引物、 dNTPs、Taq酶、PCR缓冲液、Mg2＋等，只需加入 模板即可进行扩增反应。 阳性模板：纯化的HBV －DNA，无病毒外壳，无 感染性，直接加入PCR反应管扩增后用作阳性对照。 标本处理： 每六人一组，取血清40ul加入0.5离心管，再加入 40ulDNA提取液，沸水浴10分钟，10000rpm离心 5分钟，上清用于扩增反应。 PCR反应： 每两人一组 其中一人取一PCR反应管，取1步骤离心后的上清2ul， 加入PCR反应管底层溶液中，6000rpm离心数秒。 另一人取一PCR反应管，取阳性模板2ul加入加入 PCR反应管底层溶液中，6000rpm离心数秒。 加好样的PCR反应管放入PCR扩增仪的反应板上， 扩增程序： （1）93oC 3分钟 预变性 （2）三步循环： 93oC 45秒（变性） 55oC 45秒（复性） 共35个循环 72oC 1分钟（延伸） （3）72oC 保温5分钟 （防止延伸不完整） 3. 电泳检测： 直接取PCR反应产物加入2％琼脂糖凝胶上电泳 20分钟，EB染色后在紫外灯下观察，若在314bp 处（与阳性对照处于同一位置）出现条带，则怀 疑为HBV阳性。 扩增人? – actin特异片段 每两人一组，在一0.5离心管中加入以下组分： 模板 4ul 引物 2ul dNTPs 1ul Taq酶 0.5ul 10×PCR缓冲液 2.5ul ddH2O 15ul （反应体系为25ul） （所发0.5ml离心管已加好除模板以外的所有组分，请 加入4ul昨日所提取的基因组DNA溶液即可进行扩增） 扩增程序： （1）94oC 3分钟 预变性 （2）三步循环： 94oC 45秒（变性） 55oC 45秒（复性） 共30个循环 72oC 1分钟（延伸） （3）72oC 保温5分钟 （防止延伸不完整） 扩增完成后，取8ul反应产物与2ul上样缓冲液混 合，在2％琼脂糖凝胶中电泳20分钟（每块胶加 一孔DNA Marker做对照），EB染色后在紫外灯 下观察，如果扩增成功，在155bp处有条带。 * *