02 基因工程 02演示教学.ppt

外源DNA转化法 接合转化法 是通过供体细胞同受体细胞间的直接接触而传递 外源DNA的方法。该转化系统一般需要三种不同类型 的质粒，即接合质粒、辅助质粒和运载质粒(载体)。 三种质粒共同存在于同一宿主细胞，与受体细胞 混合，通过宿主细胞与受体细胞的直接接触，使运载 质粒进入受体细胞，并在其中能稳定维持。 外源DNA转化法 电穿孔转化法 利用高压电脉冲作用，使 细胞膜上产生可逆的瞬间通道， 从而促进外源DNA的有效导人。 电穿孔转化法的效率受电场强 度、电脉冲时间和外源DNA浓度等参数的影响。此方法主要用于微生物细胞和动植物悬浮细胞或原生质体的基因转化。 外源DNA转化法 微弹轰击转化法 又称基因枪转化法，以 高压气体为动力，利用高速 运行的金属颗粒轰击细胞， 将包裹在金属颗粒表面的外 源DNA分子随金属颗粒送入 细胞的转化方法。该法简单 快速，可直接处理植物组织，接触面积大、转化率高。 外源DNA转化法 激光微束穿孔转化法 利用直径很小、能量很高的激光微束照射受体细 胞，可导致细胞膜的可逆性穿孔。根据这一原理，在 荧光显微镜下找出合适的细胞，然后用激光光源替代 荧光光源进行照射，导致细胞膜穿孔，处于细胞周围 的外源DNA分子随之进入细胞。 外源DNA转化法 超声波处理转化法 超声波处理细胞时可击穿细胞膜并形成过膜通 道，使外源DNA进入细胞。超声波处理转化法的转 化率较高，并且利用超声波处理可以避免使用电穿 孔转化时高电压脉冲对细胞的损伤，有利于细胞存 活，目前主要用于微生物细胞的基因转化。 外源DNA转化法 脂质体介导转化法 脂质体是由磷脂双分子层组成的人工膜状结构， 可以将DNA包在其内，并通过脂质体与原生质体的融 合或原生质体的吞噬过程，把外源DNA转运到细胞内。 此方法的优点是包在脂质体内的DNA可免受细胞内 核酸酶的降解，所以可直接转化外源DNA。 外源DNA转化法 体内注射转化法 利用注射仪把外源DNA 直接注入细胞的转基因方法， 可用于动植物的外源DNA的转化。这种 方法操作较为繁琐耗时，但其转化效率 很高，并且可以把外源DNA直接注入细 胞器。 外源DNA转化法 花粉管通道转化法 植物授粉过程中，将 外源 DNA涂在柱头上，使 DNA 沿花粉管通道或传递 组织通过珠心进入胚囊之 中，转化还不具正常细胞 壁的卵、合子及早期的胚胎细胞。 外源DNA转化法 精子介导法 精子同外源DNA共 浴后再给卵子受精，使 外源DNA通过受精过程 进入受精卵并整合于受 体的基因组中。 外源DNA转化法 磷酸钙转染法 某些动物细胞能捕获黏附在细胞表面的DNA-磷酸钙沉淀物，使DNA转入细胞。 将外源 DNA同CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液， 逐滴加入到不断搅拌的Hepers-磷酸钙溶液中，形成 DNA-磷酸钙共沉淀复合物；然后将沉淀复合物黏附 在哺乳动物单层培养细胞的表面；保温几小时后， 用新鲜培养液洗净细胞，再用新鲜培养茹继续培养， 直至外源基因表达 外源DNA转化法 病毒(噬菌体)颗粒转导法 用病毒(噬菌体)DNA(或RT-DNA)构建的克隆载 体或携带目的基因的克隆体，在体外包装成病毒(噬 菌体)颗粒后，感染受体细胞，使其携带的重组DNA 人受体细胞 第二章 基因工程 第六节 转化子(或重组子)的筛选鉴定 载体遗传标记检测 克隆DNA序列检测 外源基因产物检测 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因 此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转 化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重 组子 转化子 目的重组子 重组子 一、载体遗传标记检测 (一) 抗药性筛选法 抗药性筛选法的基本原理 外源DNA片段插在EcoRⅠ位点： 非重组子呈 Apr、Tcr 重组子呈 Apr、Tcr 抗药性筛选法可区分转化子与 非转化子、重组子与非重组子 将外源DNA片段插在BamHⅠ位点： 非重组子呈 Apr、Tcr 重组子呈 Apr、Tcs 抗药性筛选法的基本流程： 一、载体遗传标记检测 (一) 抗药性筛选法 将转化液涂布含有Ap的平板上 再将Ap平板上的转化子影印至 含有Ap和Tc的平板上 在Ap平板上生长、但在Ap和Tc 平板上不能生长的转化子即为 重组子 营养缺陷型筛选法的基本原理 一、载体遗传标记检测 (二) 营养