3物理图绘制知识讲稿.ppt

第三章 物理图绘制;用遗传学技术作图对于指导基因组计划的测序 阶段还是远远不够的，因为遗传图谱的局限性： 遗传图的分辨率有限：依赖于所得到的交换数目。 遗传图的覆盖面较低：重组热点、极少重组区段的存在。 遗传图的准确率有限：环境因素和取样误差，分子标记的排列有时会出现差错。;物理图谱是以物理距离来表示各遗传标记之间或DNA序列两点之间在DNA分子上的位置，以实际的碱基对长度来度量其物理距离。 ;1）限制性作图（Restriction mapping）： 它是将限制 性酶切位点标定在DNA分子的相对位置。 2）基于克隆的基因组作图 (Clone-based mapping) ： 根据克隆的DNA片段之间的重叠顺序构建重叠群 (Contig), 绘制物理连锁图。 3）荧光原位杂交（Fluorescent in situ hybridization, FISH）： 将荧光标记的探针与染色 体杂交确定分子标记的所在位置。 4）序列标签位点作图 （Sequence tagged site, STS）： 通过PCR或分子杂交将小段DNA序列定位在基因 组的DNA区段中。;3.1 限制性作图;3.1.1 限制性作图的基本方法;§3 Physical mapping §3.2 限制酶作图;3.1.2 限制性作图的局限;稀有切点限制图绘制;稀有切点限制酶;选用稀有切点限制酶酶切大片段DNA 预测稀有切点限制性内切酶酶切片段大小;PFGE的基本原理 将一个方向不断变换的电场，取代简单的单一电场（单向电场，使电泳中受阻的DNA分子在电场改变时扭转迁移方向，较小的分子比较大的分子重新排列的快，以此达到分离的目的。分辨率达到10Mb。 常规琼脂糖凝胶电泳可分辨30kb以下的线性分子，脉冲凝胶电泳可分辨10Mb的大分子;常规与非常规琼脂糖凝胶电泳;垂直交变电场电泳;均一脉冲电泳;大肠杆菌基因组物理图;3.2 基于克隆的基因组作图---大分子DNA的克隆;3.2.1 载体 质粒、噬菌体、粘粒…… 啤酒酵母基因组主要是先构建粘粒文库，然后建立克隆重叠群完成测序 高等生物基因组 拟南芥1.2X105bp，需要25000个克隆 人类基因组是拟南芥基因组的33倍;酵母人工染色体（YAC）; YAC文库装载的DNA片段的大小一般可达 200-500kb，有的可达1Mb以上。 ;YAC的主要缺点：1．存在高比例的嵌合体，即???个YAC克隆含有两 个本来不相连的独立片段；2．部分克隆子不稳定，在转代培养中可能会发 生缺失或重排；3．难与酵母染色体区分开，因为YAC与酵母染色 体具有相似的结构;4．转化效率低。 ;;细菌人工染色体（BAC）：以细菌F因子为基础，人工构建的环状的DNA分子。可以携带大于100-350Kb的外源DNA片段。 选择标记：氯霉素抗性基因等。 BAC载体的优点： 较为稳定；没有嵌合现象； 转化效率高； BAC克隆易于操作和DNA提取； BAC文库筛选方便。;质粒*;基因组文库：指将基因组DNA通过限制性内切 酶部分酶解后所产生的基因组DNA片段随机的 同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体 代表了某种有机体整个基因组。 1) 目标基因组大分子DNA的制备； 2) 载体制备； 3) 载体和DNA的连接； 4) 转化； 5) 转化子鉴定。; 目标基因组大分子DNA的制备;插入大分子DNA的分离;载体制备与插入DNA连接;染色体步移; 3.2.3 指纹作图—3种指纹;指纹作图 限制性带型指纹：用不同限制性酶处理样品，凝胶分析，DNA条带有部分相同，说明它们含有重叠的序列 重复序列DNA指纹：不同克隆酶解电泳，转移到杂交膜中，用一种或几种基因组范围的重复序列作为探针杂交，出现相同的杂交带型，说明重叠 重复序列DNA PCR：设计与重复序列互补的引物，对检测的克隆进行PCR扩增，相同的产物，说明重叠 STS目录作图：STS是已知的单一序列。设计引物，对大量的单个克隆进行PCR扩增;限制性片段指纹作图原理;限制性片段指纹电泳图;指纹重叠群构建;酵母基因组遗传图与物理图的整合;3.3 原位染色体连锁图;荧光原位杂交; 原位杂交的操作 染色体分裂细胞 染色体变性 检测信号 早期的原位杂交用的标记是放射性标记，但放射性标记很难同时满足灵敏度和分辨率两个原位杂交的必要条件。 2