5-DNA replication,mutation,injury and repair-3知识讲稿.ppt

（四）适应性突变 1988年凯恩斯等人于英国著名的《Nature》上，发表了一篇名为，《The origin of mutants》的文章， 发现了适应性突变。 凯恩斯所用的大肠杆菌的lacZ基因（其产物为半乳糖 ，可分解乳糖为葡萄糖和半乳糖）带有一个点突变，称为琥珀突变（amber mutation），这样的突变会使得lacZ基因产物转译（translate）不完全，故其产物会失去正常分解乳糖的功能─除非有突变发生，使得lacZ的产物能完全转译，否则带有这种基因的大肠杆菌便无法生长在以乳糖为唯一碳源的培养平板上。;凯恩斯的实验结果可得到两个重要的结论 乳糖可诱使Lac +突变种持续产生，而不是因为饥饿所导致； 乳糖诱使细菌产生特定方向的突变，也就是乳糖只会诱使大肠杆菌的LacZ基因产生突变，而不影响其他的基因。 ;三、突变体的分离与分析;如抗氨芐青霉素（anpr）、抗四环素(terr)、抗卡那霉素(kanr)等。当培养基中含有抗生素时，只有携带相应抗药性基因载体的细胞才能生存繁殖，这就把凡未能接受载体DNA的细胞全部筛除掉了。 如果外源目的序列是插入在载体的抗药性基因中间使这抗药性基因失活，这个抗药性标志就会消失。;例如质粒pBR322含有anpr、和terr两个抗药基因，若将目的序列插入terr基因序列中，转化大肠杆菌，让细菌放在含氨芐青霉素或四环素培养基中，凡未接受质粒DNA的细胞都不能生长； 凡在含氨芐青霉素和四环素中都能生长的细菌是含有质粒pBR322的，但其pBR322未插入目的序列， 凡在氨芐青霉素中能生长、而在四环素中不能生长的细菌就很可能是含有目的序列的重组质粒。 ;⑵β-半乳糖苷酶法 载体含有lacZ’的蓝白筛选法：蓝白筛选法是一种利用蓝色化合物作为指示剂的筛选方法，筛选含有编码β-半乳糖苷酶的基因。主要是在载体的非必要区插入一个大肠杆菌β-半乳糖苷酶的基因片段lacZ。携带lacZ 的载体转入lac-的宿主菌后，在含有X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)平板上可形成蓝色菌落。外源基因插入lacZ（或lacZ被取代）后，重组子将丧失分解X-gal的能力。转入lac-的平板上可形成白色菌落。 ;2. 核酸杂交法： 利用标记的核酸做探针与转化细胞的DNA进行分子杂交，可以直接筛选和鉴定目的序列克隆。常用的方法是Southern 印迹杂交和斑点杂交等。将转化后生长的菌落复印到硝酸纤维膜上，用碱裂菌，菌落释放的DNA就吸附在膜上，再与标记的核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在含有目的序列的菌落DNA上而不被洗脱。核酸探针可以用放射性核素标记，结合了放射性核酸探针的菌落集团可用放射性自显影（autoradiography）法指示出来，核酸探针也可以用非放射性物质标记，通常是经颜色呈现指示位置，这样就可以将含有目的序列的菌落挑选出来。 3. PCR技术（见书）;血友病B（HB）：是FIX缺乏或其凝血功能降低的一种遗传性出血性疾病。本病发生是由于位于X染色体上的FIX基因突变所致。FIX是一种维生素K依赖性凝血因子，在肝细胞中合成。 21-羟化酶（CYP21）缺陷与先天性肾上腺皮质增生症。21—羟化酶基因定位于第6号染色体短臂（6p21.3），与HLA基因族紧密连锁，由A基因（CYP21A）和B基因（CYP21B）两个基因座构成，CYP21B又称CYP2的，是21—羟化酶的编码基因：CIP21A又称CYP21p，是无功能的假基因。CYP2的基因突变，包括点突变、缺点和基因转换等，致使21—羟化酶部分或完全缺乏，由于皮质醇合成分泌不足，雄激素合成过多，致使临床出现轻重不等的症状。 ;五、基因突变在药物评价中的应用;第三节 DNA的修复系统 一、复制修复 (一）尿嘧啶糖基酶系统： 该系统能切除错误掺入的尿嘧啶核苷酸，①首先由尿嘧啶N-糖基酶切除U；②由AP内切酶切除与U相邻的一段核苷酸，形成缺口；③由聚合酶I按正确的碱基配对合成填补缺口；④由连接酶封闭缺口。;3’AGTGACTTAG5’ 5’TCACTGAATC3’;（二）错配修复： DNA错配修复基因是生物进化过程中的保守基因，有修复DNA碱基错配、增强DNA复制的忠实性、维持基因组稳定性和降低自发性突变的功能。 大肠杆菌在DNA复制过程中，有两种机制保证复制的正确性，一是Pol Ⅲ的校正功能，即3’→5’外切酶活性，可将错误连接的核苷酸切除。但仍有错误的碱基合成到新链，这时由错配修复系统修复。;错配修复系统进行修复时首先要识别哪条链是含有错误碱基的新链，哪一条是需要保留的母链。大肠杆菌中识别标记就是母链中甲基化的腺嘌呤。 原核细胞内存在Dam甲基化酶，能使位于5’GATC序列中腺苷酸的N6位甲基化。 复制后