DNA甲基化培训课件.ppt

DNA 甲基化同众多疾病的发生与发展密切相关，比如Ⅱ型糖尿病、自身免疫疾病以及各种癌症。 特别是癌症，其发生过程中癌细胞基因组整体的欠甲基化和局部区域的超甲基化是其典型特征。 超甲基化体现在抑癌基因的启动子区被异常甲基化，整体的欠甲基化同重复序列(如转座子)以及癌基因的启动子区的甲基化程度减小、基因组遗传不稳定性的增加密切相关。 甲基化异常与疾病 Alu 序列是重新甲基化过程中的甲基化中心，在甲基化转移酶的作用下，DNA 甲基化从 Alu 序列出发往外延伸，当CpG 岛周围富集的转录因子结合位点同具有锌指结构的转录因子结合以后则可以阻止甲基化向CpG 岛的蔓延，因此在这种阻止与蔓延的作用达到动态平衡以后，就形成了比较稳定的甲基化模式。 当细胞所在的环境发生变化时，这种平衡可能会被打破，阻止功能的增强或者侵入能力的提高则可能使 DNA 甲基化往 CpG 岛外或者往内移动，从而建立新的平衡。 比如，如果某些顺式元件发生突变，则本可以结合并阻碍 DNA 甲基化蔓延的特定转录因子可能因为结合能力的减弱使其阻碍功能变弱甚至消失，这种情况下，其附近的 CpG 岛可能会被甲基化。 因此，发生癌变的组织中抑癌基因的异常甲基化以及与老化过程相关的甲基化可能是由于这种保护机制的减弱造成的 Bibikova 等 对结肠癌、乳腺癌、肺癌和前列腺癌细胞系以及正常细胞中 371 个基因中的 1 536 个位点的甲基化状态进行聚类分析，发现各种癌症都存在其特异的 DNA 甲基化生物标记． 甲基化的分析检测 DNA 甲基化的检测大体分为两个步骤： a．待检测样品的前期处理； b．目标序列的定位和甲基化状态的量化。 待检测样品的前期处理方法主要包括三大类： a．亚硫酸氢钠法——亚硫酸氢钠把非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而保持甲基化的胞嘧啶不变，以此实现两类的分离； b．限制性内切酶法——限制性内切酶可以切割非甲基化的位点，而甲基化以后的识别位点将被保留； c．利用特定抗体对甲基化的胞嘧啶进行免疫沉淀反应． 前期处理实现了甲基化和非甲基化的胞嘧啶分离以后，可以对分离出的甲基化 DNA 片段进行基因芯片杂交或者大规模深度测序，实现高通量的检测。 简单地把DNA甲基化理解为“一把锁”，凡是被DNA甲基化标记的部分，大都是需要被“尘封”“监禁”的基因，比如基因组的“捣蛋鬼”—转座子，就是被甲基化这把“锁”管制着，失去管制或管制不严，这些“捣蛋鬼”会在基因组里跳来跳去，把基因组搞得一团糟，会引起很多问题，如肿瘤、精神疾病等。 酵母与果蝇基因组中未能检测到任何甲基化CpG，这两种生物并不依赖DNA甲基化的方式来控制基因活性，它们采用其它的机制来达到同一目的。 脊椎动物与高等植物普遍利用DNA甲基化作为重要的调控机制。 指在 DNA 甲基转移酶 (DNMTs)的作用下，以 S -腺苷甲硫氨酸 ( SAM )为甲基供体，将甲基添加在 DNA分子中的碱基上。 常见的 DNA 甲基化发生在 DNA 链上的胞嘧啶第 5位碳原子和甲基间的共价结合，胞嘧啶由此被修饰为5甲基胞嘧啶 ( 5mC) 。 DNA甲基化的分子机理 哺乳动物基因组中约有 5%- 10%是 CpG位点，其中约有 70%为 mCpG。 CpG 位点不是均匀分布，而是呈现局部聚集倾向，形成一些 GC 含量较高、CpG 双核苷酸相对聚集的区域，即 CpG 岛。 CpG岛 CpG岛主要位于基因的启动子区，少量位于基因的第一个外显子区；其甲基化状态直接影响基因表达。 甲基化的 CpG 双核苷酸通过募集转录抑制因子或者阻碍转录激活因子的结合抑制基因的表达。 CpG岛一般是非甲基化的，而在失活 X染色体、印记基因和非表达的组织特异基因中则是甲基化的。 成体基因组通常中，奢侈基因呈现高密度甲基化，而含有丰富 CpG 岛的管家基因则呈非甲基化。 基因组甲基化的特点： 可逆性——许多甲基化位点可以根据细胞活性的要求重新甲基化或去甲基化； 组织特异性——不同的组织细胞具有不同的甲基化模式，为基因表达设定程序。 异常的甲基化可分为高甲基化和低甲基化 ，前者指正常组织中不发生甲基化的位点被甲基化 ，后者是指在正常组织中发生甲基化的位点去甲基化。 Dnmts 3a 3b 1 ? De novo DNA methylation Active demethylation Maintenance methylation X Passive demethylation How methl group added 甲基化酶 一般按甲基化的方式将甲基化酶（DNA methytransferase，DNMT）分为2类： 一种是维持型甲基转移酶，需以半甲基化的双链 DNA 为模板，指导新合成的链甲基化； 一种是