四川大学基因工程原理张正义教授上课ppt教学教材.ppt

分子克隆工具酶及其应用;分子克隆工具酶及其应用;第一节 限制性内切核酸酶; 一??? . 限制性内切酶的发现 1.?细菌限制修饰系统的发现 Werner Arber于1962-1968年发现，1968年分离到I型限制酶。 2. 限制酶HindII的发现 H．O．Smith 和Wilox 于1970年首次从流感嗜血杆菌（H. influenzae）中发现并分离到HindII限制酶。 3. SV40 限制图谱和转录图谱的绘制 D. Nathans（1971年）用HindII绘制SV40的限制酶谱。 ;二? . 限制修饰系统的种类 1.?I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（host specificity for DNA restriction modification and specificity）位于染色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸）。 2.?II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅ. coli中这两种基因位于质粒上。 3.?III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。 上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。 ; 三. 限制性内切酶的定义、命名 1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指II型限制酶。 2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。 　例如：HindⅢ　　前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。 EcoRI—Escherichia coli RI HindⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ SacI (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ);四．限制酶的特点 1. 识别顺序和酶切位点 １）识别４-8个相连的核苷酸 MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC：PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC CCGGN’N’N’N’N’CCGG Fok I 5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’ 3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突起 ２）富含ＧＣ;;五. 异源同序酶（isoschizomer，同裂酶） 1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制 酶 2. 特点：1）识别相同顺序 2）切割位点的异同 KpnI GGTAC C Asp718 G GTACC SstI CCGC GG SacI CCGC GG 限制酶的星反应（star activity） 1.?特点: 限制酶识别序列特异性降低 2.?发生星反应的限制酶和条件（见下页） 3.?星反应的利用和避免;表1 具有星反应的限制性内切酶与条件 限制酶　　　　诱发星活性的条件a　　　　识别序列 AvaI 1, 2, 4 BamHI 1 - 5, 8 G GATCN, G PuATCC BstI 2, 4 BsuI 2, 4, 6 EcoRI 1, 2, 4 - 6 N AATTN HaeⅢ 2, 4 HhaI 2, 4, 7 HindⅢ 6 HpaI 1, 2, 4 PstI 1, 2, 4, 7 PvuⅡ 2, 4 SalI 1, 2, 4, 7 ScaI 4 - 6, 8 SstⅡ 2, 4 XbaI 2, 4, 7 a.1：亚乙二醇(