基因操作原理-孙明培训课件.ppt

平台效应 plateau effect 在PCR反应后期,产物的积累按减弱的指数速率增长(一般已积累到0.3～1pmol产物) 原因: 底物浓度降低， dNTP or Primers dNTP or enzyme的稳定性 末端产物抑制(pyrophosphate焦磷酸, dsDNA) 非特异性竞争(非特异性产物or primer-dimer) 特异性产自身复性(10-8M) 高浓度产物下,变性不彻底. 避免出现背景 5．反应液的配制 (1) 常规 最后加酶,及矿物油 (2) 具3’-5’活性酶 A:template, primer, dNTP H2O B:buf enzyme H2O (3) 热起始 下层:dNTP buf primer 中间:蜡珠(Ampli Wax PCR Qam100) 上层: template (Taq) ·先加下层液,再一粒蜡株,70℃ 10min 5℃ 5min ·迅速加30?l上层混合物 四、PCR介导的克隆 (一)添加限制性酶切位点 1.引物的设计 (引入酶切位点） 切点的类型 优先8 base序列, 如AscI NotI PacI, PmeI, SfiI, SrfI 若内部序列为已知, 则可根据需要进行设计 切点的位置 参见限制性内切酶部分 如EcoRI, 5’端有一个C，在2hr内可切割?90% HindIII 5’端有3个C 在2hr内可切割?10% 20hr内可切割?75% 2．综合处理 (当酶切位点在最末端时) Kinase 处理，在5’端加一个磷酸 Klenow补平 Ligase连接成多聚体 酶切，回收目标DNA片段 （二）A/T克隆法 1. PCR产物：Taq poly 产物的3’末端 一般要在3’末端加一个核苷酸, 通常为A （Vent, Pwo, Pfu等的产物为平末端） 2.载体 pGEM-T, pGEM-T Easy (promega) pCR-3, pCR-II, pCR-3-Uni (半磷酸化)(Invitrogen) 核心 线性DNA ·末端转移酶加ddTMP ·产生单个T的限制性内切酶 如MboII, XcmI, HphI, HphI, GGTGA(8/7) MobII, GAAGA(8/7) ·Taq DNA poly +高浓度dTTP （三）平端克隆法 用于克隆具3’→5’外切活性的DNApoly扩增的PCR产物 ·pCR Script (stratagene) 类似pBlue script MSC:NofI SrfI, BamHI, SmaI, PstI, EcoRI, EcoRV H3 SrfI:GCCC↓GGGC SmaI,CCC↓GGGC ·pCR Script SrfI （四）不需要连接反应的克隆方法 1．UDG克隆法 UDG酶是参与TTP生物合成的一种酶，水解脱氧核糖与尿嘧啶之间的N-糖苷键,产生脱碱基的dU,从而破坏DNA的碱基配对 2．外切法 3．PCR介导的亚克隆 （五）反向PCR (inverse PCR) 略 （六）长片段的PCR克隆 许多公司开发出一些用于扩增长片段的反应体系 多用混合酶(如Pwo, Pfu) 来扩增 4．寡核苷酸 5‘ Kinase, 3’ 末端转移酶 5．标记物 放射性: 32P，33P，35S 非放射性: Digoxigenin, Biotin 用于标记 dUTP (五) DIG标记/检测举例 1.探针标记 6 Nt随机寡核序列苷酸引物, Klenow标记 2．检测 漂洗 blocking 免疫反应 labeled Anti-DiG-Ab-Ap 洗涤 显色反应 化学发光检测 NBT-BCIP 形成棕黄色沉淀 BCLP：5-溴-4-氯-3’吲哚磷酸 NBT: 氯化硝基四氮唑蓝（染料色素） CIP的底物, 也称氮蓝四唑 优点：无污染，方便，探针可重复使用，可控制显色反应，保存杂交膜，易辩别真假阳性 缺点：灵敏度不够，不能多次杂交， 只有0.1pg可检测单拷贝，如?g人胎盘DNA中的单拷贝 Kb ladder 2kb 二、原位杂交 菌落杂交和空斑杂交 1. 菌落生长 点种: 将阳性重组子?二个平板上(有/无膜)