基因编辑 2016.08.11知识讲稿.pptx

2016.8.11刘亭报告内容基因编辑简介CRISPR/Cas9 (2013，第三代基因编辑技术，目前最靠谱)NgAgo-gDNA（2016，第四代基因编辑技术，还不靠谱？）TELEN（2011，第二代基因编辑技术）ZFN （2001，第一代基因编辑技术）四代基因编辑技术的比较基因编辑技术的其它应用基因编辑概念对基因组进行人工定点修饰，包括敲除、敲减、插入、修正目的基因意义证明基因功能不可缺少的逻辑环节基因工程和基因治疗的重要手段技术Suicide plasmid，RNAi，ZFN，TALEN，CRISPR/Cas9，NgAgo-gDNA细菌的获得性免疫系统——CRISPR/Cas9产脓链球菌（SF370）31N 2CRISPR基因 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) Cas基因 (CRISPR-associated)TrancrRNA基因(Trans-activating crRNA)Cas9 Cas1 Cas2 Csn2转录DNATrancrRNA翻译转录转录Cas 蛋白Pre-crRNA组合扫描入侵的病毒或质粒 DNAPAM互补配对剪切入侵的病毒或质粒 DNA不能复制和整合基因编辑工具——CRISPR/Cas9转化T细胞，表达T细胞基因组DNAPAM扫描CCR5 TrancrRNA CCR5 Cas9互补配对剪切CCR5基因突变Cas9剪断的基因非同源末端连接修复同源重组修复同源重组修复基因突变基因修正基因插入Figure 1 NgAgo uses 5′ phosphorylated ssDNA guides and cleaves DNA targets in vitro. Figure 2 NgAgo binds ssDNA guide in a oneguide-faithful manner.Figure 3 NgAgo works as an endonuclease and can cleave DNA targets in vivo.Figure 4 NgAgo can make targeted double-strand breaks in mammalian genome. Figure 5 NgAgo can be used to edit mammalian genome.NgAgo-gDNA系统优势1.容错率低，错配一个碱基就明显影响了NgAgo的效率，而错配三个就不起作用了；2.5-p-ssDNA在哺乳动物内稀少，这也就决定了胞内不会有gDNA带着NgAgo乱搞；3.NgAgo一旦与5-p-ssDNA结合就不会再与其他的5-p-ssDNA结合；以上三条都是讲NgAgo脱靶效应低；4.ssDNAs易于设计和合成，因为它不依赖于PAM序列，比较容易推广应用。TALEN（transcription activator-like effector nuclease）转录激活样效应因子核酸酶TALEN基因敲除基本流程——确定靶点1 选择目标基因外显子中相隔17-18bp的两段14-18bp序列作为靶点TALEN基因敲除基本流程——载体构建2.1 TAL靶点识别域的克隆构建TALEN基因敲除基本流程——载体构建2.2 将TAL靶点识别域克隆入特定的真核表达载体TALEN基因敲除基本流程——转化敲除基因3 将重组真核表达质粒转入（卵）细胞以表达重组核酸酶，敲除基因TALEN基因敲除基本流程——筛选突变体4. 筛选突变体锌指核酸酶（Zinc-finger nuclease, ZFN）技术第一到第四代基因编辑技术的比较NgAgo-gDNANgAgo-gDNAgDNA脱氧核糖核苷酸Ago蛋白多位点编辑20bp双链断裂；单链缺刻非常容易？较轻？CRISPR/Cas9技术应用——不只是基因编辑 TrancrRNA GOI dCas9转录调控，表观修饰等TALE技术应用——不只是敲除 靶向基因敲除，敲入，转录调控，表观修饰CRISPR/Cas9研究历史1987年，日本科学家在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列。随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，2002年，正式将其命名为CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)成簇的规律间隔的短回文重复序列。2005年西班牙科学家发现CRISPR 的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质（如噬菌体基因组序列）高度同源，推测细菌可能通过CRISPR系统可