八单元基因工程1节.ppt

电穿孔法转染哺乳动物细胞 ①转染前按照实验设计取出欲转染的 DNA(1－ 20μg用于稳定转染，瞬时转架可观用到10-40μg)，用乙醇沉淀法进行浓缩并灭菌，临转染前在洁净工作台内将 DNA溶解在10μl TE中 ②培养细胞至 50％－75％汇合， 4℃下 640g离心5 min，收获细胞，若为贴壁细胞，可用胰蛋白酶消化并用血清将胰蛋白酶灭活 ③用原培养基 1／2体积的冰浴预冷电穿孔缓冲液重悬细胞，4℃ 640g离心 5min，弃上清 ④用冰浴预冷电穿孔液重悬细胞,1×107个细胞／ml，用于稳定转染， 8×107四个细胞／ml用于瞬时转染 ⑤在每个电穿孔专用细胞小室（Cuvette）中加人 0.5ml细胞悬浮液并置于冰上 ⑥加人欲转染 DNA，手指轻弹混匀，冰上放置 5 min ⑦将电穿孔杯置于电穿孔仪内，在优选的条件下电击一次或多次。电压、电容及电击次数因细胞不同而异，应进行优选。一般电压为250-750V／cm，电容为25μF，脉冲时间为20-100 ms ⑧电穿孔杯置于冰上10min ⑨用20倍体积的非选择性完全培养基稀释转染细胞并淋洗电穿孔杯以移去所有转染细胞 ⑩稳定转染实验在非选择性培养基中培养48h（约两代）后更换选择培养基，瞬时转染则在转染 48－ 72 h后收获细胞，进行表达水平检测。 2.显微注射法 该法虽然费力，但却是非常有效的将核酸导人细胞或细胞核的方法。这种方法常用来制备转基因动物，但不适用于需要大量转染细胞的研究。 3.基因枪法 该法依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导人细胞内，这种方法适用于培养的细胞和在体的细胞。 需要注意的是，没有一种方法是万能的，应根据具体情况进行选择。但无论选用何种转染方法，DNA的质量和数量对转染成功与否至关重要。用于转染的质粒DNA必须没有蛋白质。RNA和其它化学物质污染，可用CSCI梯度离心、柱层析法或质粒DNA提取试剂盒制备DNA。吸光度A260nm与A280nm的比值应在1.8－1.9之间。转染前用乙醇沉淀DNA，再加人适量灭菌水或TE缓冲液溶解DNA，至终浓度为1mg／ml左右。对于不同的细胞，质粒DNA转染所需的量不同，因此在实验开始以前需要优化实验条件。需要优化的参数主要有：脂质体与DNA的比例，转染DNA的总量，细胞接触脂质体的时间及是否存在血清等。细胞状态、密度、传代次数及污染也会影响转染效率。 （三）病毒感染 病毒颗粒是一类十分有效的基因释放系统，因此，它是将外源基因导人大量细胞最有效的方法。病毒感染具有高效率、可稳定遗传、适用于各种不同来源的细胞及操作简单等优点。但多数病毒有其潜在的危险性，操作者需要有一定的病毒操作经验和良好的设施。病毒表达系统内容十分丰富，其应用已越来越广泛。 第十节 克隆DNA的定点诱变和片段删除 一、定点诱变 体外定点诱变包括缺失、插与碱基替代。 应用PCR技术体外碱茎替代，是研究基因功能有效的方法。 碱基替代有重叠延伸法和单突变引物PCR法 （一）原理 两种PCR产物序列一端重叠，均含有PCR引物引入的突变位点。除去未参入的多余引物，两种产物变性混合，可形成了凹端的异源双链。这种凹分端可由Tal DNA pol延伸产生一个两重叠产物的重组体。该重组体可由两片段的外测引物进行PCR扩增，因此可产生一种远离片段末端的突变体。 理解要点： ①一对引物（如a、b）决定了待扩增DNA片段的大小（如a与b之间的DNA片段）。 ②两对引物（a与b，c与d）之间引物的重叠（b与c）必然导致（复制）扩增产物的重叠（互补）。 ③所谓异源，即左侧和右测PCR两套产物交叉5′5′重叠和3′3′重叠。 ④DNA pol只能将dNTP加在3′一OH末端上，用外侧引物（a和d）PCR得到远离片端末端的重组突变体 注：突变位点（替换碱基）越靠5′端，对PCR的影响就越小。 （二）方法 1）合成引物：一对“内侧”引物，即带有突变位点的互补的寡核昔酸（上 图b、c），一对“外测”引物（a、d）。 2）第一次PCR（左、右侧重叠PCR）： 反应体系应“一多两少两优化”，即： 起始模板尽量多 优化复性条件 DNTP（50～200mol/L）尽量少 优化延伸温度 循环次数尽量少 以保证Taq酶忠实性，（避免Taq错误掺入率与突变点混淆），避免造成产物分析困难。 3）去除多余引物方法有： ①凝胶电泳 ②centricon100选择性过滤 ③醋酸铵/异丙醇沉淀 4）第二次用外侧引物（a、d）PCR，凝胶电泳纯化产物。 ② ‘（二）’——