八单元基因工程3节.ppt

意义： 如果这个文库足够大，能包含该生物基因组DNA全部的序列，就是该生物完整的基因组文库，能从这文库中钓取该生物的全部基因或DNA序列。从基因组含有生物生存、活动和繁殖的全部遗传信息的概念出发，基因组文库是具有生物种属特异性的。 特点及应用： 包含所有遗传信息 构建难度大（单拷贝基因、长片段基因） 筛选难度大 用于研究基因在基因组中的情况 （二）cDNA文库构建 以mRNA为模板，经逆转录酶催化合成DNA，则此DNA序列与mRNA互补，称为cDNA。提取出组织细胞的全部mRNA，在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。 基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。 cDNA文库比基因组DNA文库小得多，筛选细胞特异表达的基因比较容易。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 从cDNA文库获取目的基因 逆转录酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱水解 T T T T 目 录 1. 总RNA提取及mRNA制备 真核生物中的RNA 80-85%为rRNA，10-15%为tRNA或SnRNA，上述RNA分子具有确定的大小，可以用电泳、离心等方式纯化。 mRNA后有PolyA尾巴，可以利用PolyT分离。 2. cDNA的合成 3.cDNA克隆 cDNA文库的构建 cDNA 文库，cDNA library 逆转录 mRNA cDNA 第五节 载体DNA与目的基因的连接 （一） DNA分子间连接策略 （二） 影响目的基因与载体之间连接效率的因素 粘性末端连接 平端连接 同聚物加尾连接 人工接头连接 （一） DNA分子间连接策略 连接目的基因和载体，形成重组DNA分子。 1. 粘性末端连接 DNA连接酶 “缝合”基因的 “分子针线”。 2. 平端连接： 平末端用T4DNA连接酶连接，只是效率低，需要的DNA浓度更高。 粘性末端连接 将目的序列和载体用一个或两个相同的限制性核酸内切酶消化，则同一限制酶酶切产生的粘性末端，在 T4 DNA连接酶催化下，目的序列就可以与载体连接。 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 同一限制酶切位点连接 不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接 Eco RⅠ切割位点 GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA G G CTTAA AATTC A TCTAG GATCT A Bg lⅡ切割位点 T4 DNA连接酶 15oC G CTTAA A TCTAG AATTC G GATCT A 重组体 配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。 AATTC G A TCTAG AATTC G GATCT A G AATTC TCTAG A + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 平末端DNA片断的连接 1. T4DNA连接酶 2. 用末端核苷酸转移酶给平末端加上同聚物尾巴之后，再用DNA连接酶连接。 常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接物法和接头连接法 在末端转移酶作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列，如将poly（dC）加到双链DNA片段3‘ 羟基上，而将poly（dG）加到质粒载体3’ 羟基上，制造出粘性末端，然后通过退火进行粘性末端连接。 3. 同聚物加尾连接 人工接头（linker）是指人工合成的一段双链寡核苷酸，其中包含一个（或两个）酶切位点。首先将接头与目的DNA片段进行平末端连接，继而用适当的内切酶将接头部位切出粘性末端，最后与载体进行粘性末端连接。 4. 人工接头连接 载体5‘端脱磷酸化 由于具粘性末端的载体易发生自连。 对载体的5’末端进行处理，用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶移去磷酸基团，使载体不能自