过程分子生物学1节.ppt

1F 真核生物sRNA介导的RNA干扰 RNA分子在遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程中扮演着重要的角色，但几十年来有关RNA的消息只能听到微弱的声音。近年来一连串的发现表明，一类被称为小分子RNA（small RNAs）的物质操纵着很多生命过程。它们能改变基因的表达水平甚至关闭基因、编辑基因组、哄骗细胞形成特定的组织。因此该领域的研究成果被《Science》杂志连续两年（2001-2002）评为年度十大科 学成就之一。 1F 真核生物sRNA介导的RNA干扰 a RNA干扰作用的发现 1995年，康奈尔大学的Su Guo在用人工合成的反义RNA阻断线虫基因表达的实验中偶然发现，反义RNA和正义RNA都能阻断靶基因的表达，他对这个结果百思不得其解。直到1998年，美国卡内基研究所的Andrew Fire用确凿的实验结果证明，在正义RNA阻断基因表达的实验中，真正起作用的是小分子的双链RNA，它们是体外转录正义RNA时生成的。上述双链RNA对基因表达的阻断作用称为RNA干扰（RNAi）。随后大量的研究发现，RNAi 现象广泛存在于线虫、果蝇、斑马鱼、真菌、植物等生物体内，它们借助于RNAi 抵御病毒的感染，阻断转座子 的转座作用，以维持其基因组的相对稳定性。 1F 真核生物sRNA介导的RNA干扰 a RNA干扰作用的发现 RNA干扰与先前所说的转录后基因沉默、转基因沉默等术语都是一回事，但常与基因表达的反义抑制相混淆。反义抑制过程并不涉及mRNA的催化降解，只是单链反义RNA物理上与mRNA结合并阻断其翻译。Andrew Fire 和 Craig Mello因他们关于线虫RNA干扰的研究（1998）而分享2006年的诺 贝尔生理学或医学奖。 b RNA干扰的作用机理 外源性的双链RNA，不管来自病毒RNA基因组的感染还是人工的导入，均在细胞质中被Dicer酶裁剪成20-25bp的短小双链片段，即 small interfering RNA（siRNA），其3’端含有两个凸出的碱基，负责siRNA的迁移和对靶序列的识别。在RISC复合物的协助下，双链siRNA拆成单链，然后再与具有互补序列的靶mRNA分子结合，形成局部双链。后者或遭RNase的降 解，或直接阻断靶mRNA的翻译。 1F 真核生物sRNA介导的RNA干扰 c 细胞内固有的miRNA 前已述及，siRNA是由体外来源的双链RNA经细胞内的Dicer酶加工 的sRNA被命名为：microRNA（miRNA）。 进一步的探索发现：在动物、植物、真菌的细胞核内，从结构致密的异染色质中心粒区域的DNA重复序列上会转录出一些特殊的RNA前体大分子，它们同样在类似蛋白因子的作用下，形成长度为21-23个碱基的单链sRNA分子，并发挥特殊的生物学功能。这种细胞内编码的固有 而成的。那么细胞内是否也存在着固有的RNA类似物呢？ miRNA的形成 首先从异染色质中心粒区域的DNA重复序列上转录出大分子的非编码型RNA前体（pri-miRNA），后者在核内被微加工器复合物（由RNaseIII组成）先切成大约70个核苷酸的茎环结构（pre-miRNA），然后再被运输到细胞质中由Dicer进一步裁剪，形成成熟的miRNA分子，最后再由几种因子装配而成。 Science 319, 1787, 2008 miRNA的生物功能 异染色质装配 外成性修饰 转录调控 转录物剪切调控 转录物稳定调控 翻译调控 结构域构成 1F 真核生物sRNA介导的RNA干扰 d RNA干扰原理的应用 如果将外源的双链RNA导入细胞中，则双链RNA分子一方面在Dicer的作用下裂解成siRNA；另一方面在以RNA为模板的RNA聚合酶RdRP的作用下自身扩增，其扩增产物再被Dicer裂解成siRNA。后者解链并与RISC复合物一起作用于靶mRNA上，一方面使其降解，另一方面又以siRNA作为引物，mRNA为模板，在RdRP催化下合成出mRNA的互补链，结果mRNA也变成了双链RNA。它在Dicer的作用下也同样被裂解成siRNA。通过这种体内的RNA聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。相关研究结果表明，从21-23个碱基的siRNA到几百碱基对的双链RNA都能诱发RNA干扰作用，但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显优于短的双 链RNA。 1F 真核生物sRNA介导的RNA干扰 d RNA干预原理的应用 上述RNA干扰原理在分子生物学研究领域中的用途包括： 通过基因表达的特异性阻断作用，确定基因的功能 通过基因表达的特异性阻断作用，实施基因治疗 然而，如何将特定的