分子遗传学人类基因组计划 课件.ppt

基因组计划的基本目标是获得全基因组顺序，在此基础上再对所获得的序列进行解读。获得基因组顺序的主要方法是进行DNA测序，然后再将读取的顺序组装。目前的DNA测序每次反应仅能读取不到1000bp的长度，已知最小的细菌基因组为580kb。因此基因组测序的第一步是构建基因组图，然后将基因组区段分解逐个测序，最后进行组装。基因组作图的基本构想是，在长链DNA分子的不同位置寻找特征性的分子标记，根据分子标记将包括这些序列的克隆进行连锁定位，绘制基因组图。一旦构建好基因组图，即可着手进入全基因组测序。以基因组图指导的测序有2种路线： 重叠群法 和 直接鸟枪法 人类基因组测序策略 重叠群法 以大片断定位的克隆为基础的定向测序战略主要采用克隆步移法或称重叠群法：先构建遗传图，再利用几套高度覆盖的大片段基因组文库（BAC、PAC等）获得精细的物理图，选择合适的BAC或PAC克隆测序，利用计算机拼装。BAC内的空洞基本上都可以利用设计引物等手段填补，形成一条完整的BAC序列。然后由相互关联、部分重叠的BAC克隆连成一个大的重叠群（Contig）。理想状况下，整条染色体就是由一个完整的重叠群构成。 但通常情况下部分BAC之间会有物理空洞（Physical Gap），这是目前国际上还未克服的难题。利用克隆步移法测序，国际上通行的标准要求BAC测序达到十倍覆盖率，使所测的序列达到99.99％以上的准确度。该方法的技术难度较高，尤其大片段基因组文库（BAC）和精细物理图构建是技术性极强的工作； 此外，费用相对于鸟枪法要稍高一些，完成整个基因组测序周期也要长些。但是，通过这种方法得到的基因组数据是最为准确和精细的数据，也是基因组测序的最终目标。大基因组完成图目前大多都是通过这种方法获得的。基因组完成图，即完全覆盖所测物种的基因组、准确率超过99.99％的全DNA序列图。完成图的覆盖率接近100％，准确率更高，达到99.99％。 什么是鸟枪法 全基因组随机测序战略主要采用鸟枪法（shotgun）。鸟枪法，也俗称“霰弹法”，是随机先将整个基因组打碎成小片段进行测序，最终利用计算机根据序列之间的重叠关系进行排序和组装，并确定它们在基因组中的正确位置。 “鸟枪法”优点是速度快，简单易行，成本较低，可以在较短的时间内通过集中机器和人力的方法获得大量的基因片断。 但是用它来测序，最终排序结果的拼接组装比较困难，尤其在部分重复序列较高的地方难度较大。此外有许多序列片段难以定位在确切的染色体上，成为游离片断；同时又会有许多地方由于没有足够的覆盖率而形成空缺。这些缺陷最终导致整个基因图会留下大量的空洞（gap），也影响其准确度。 基因组测序的不同策略 重叠群法 所谓重叠群系指相互间存在重叠顺序的一组克隆。根据重叠顺序的相对位置将各个克隆首尾连接，覆盖的物理长度可达百万级碱基对。在单个的重叠群中，采用鸟枪法测序，然后在重叠群内进行组装。这是一种由上至下（up to down）的测序策略。 直接鸟枪法 首先进行全基因组鸟枪法测序，再以基因组图的分子标记为起点将鸟枪法DNA片段进行组装。高密度的基因组图分子标记可以检测组装的DNA片段是否处在正确的位置，并校正因重复顺序的干扰产生的序列误排。这是一种由下至上（bottom to up）的测序策略。 国际人类基因组测序策略 构建BAC克隆 ↓ 限制性酶处理获得指纹 ↓ 根据指纹重叠方法组建BAC克隆重叠群 ↓ 根据STS标记,将BAC克隆重叠群标定在物理图上 ↓ 每个BAC克隆内部采用鸟枪法测序,组装 ↓ 将BAC插入顺序与BAC克隆指纹极重叠群对比,将已阅读的顺序锚定到物理图上 Celera Genomics 人类基因组的测序策略 采集5个自愿者的DNA样品 构建3种不同插入子大小的基因组文库2Kb, 10Kb和50Kb PFP发表的公开数据主要为BAC克隆的顺序,共4443.3Mb 完成约2700万次插入子末端测序,总长14800Mb GeneBank下载104018个BAC末端顺序 随机测序与序列组装方法和 指导测序与序列组装方法 相结合进行序列组装 运用计算机软件进行序列拼接 人类基因组的基本特点 1.断裂基因； 2.主要由大量的非编码序列和少量的编码序列构成； 3.存在多基因家族。 4.含有多种类型的重复序列； 人类基因组研究大事记（一） １９９０年 ，１０月，人类基因组计划在美国正式启动。 １９９１年 ，美国建立第一批基因组研究中心。 １９９３年 ，桑格研究中心在英国剑桥附近成立。 １９９７年 ，法国国家基因组测序中心成立。 １９９８年 ，中国在北京和上海设立国家基因组中心。 ５月，一批科学家