6基因工程和基因体外表达.ppt

第八章 基因工程与体外表达 ; 基因工程是指在体外对DNA分子按照既定的目的和方案，对DNA进行剪切和重新连接，然后把它导入宿主细胞，从而能够扩增有关DNA片段，表达有关基因产物，进行DNA序列分析，基因治疗，研究基因表达的调节因子，以及研究基因的功能等。 ;?????第一节 基因克隆的工具酶 一、限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease） 从双链DNA内部特异位点识别并且裂解磷酸二酯键。 ;1. 限制性核酸内切酶的特点 类型 限制性 修饰作用 识别位点 切割位点 Ⅰ型 有 有 特异 识别位点下游100到1000bp Ⅱ型 有 无 特异 可知、固定 Ⅲ型 有 有 特异 识别位点附近切割DNA， 切割位点很难预测。;2．限制性内切酶的命名 EcoRⅠ E代表Escherichia属 co代表coli 种 R代表RY13株 ;3．限制性内切酶的识别和切割位点 通常是4～6个碱基对、具有回文序列（palindrom）的DNA片段，大多数酶是错位切割双链DNA，产生5ˊ或3ˊ黏性末端（sticky end）。 ;PstⅠ切割后产生3ˊ黏性末端：;Date;Date;2. DNA聚合酶Ⅰ大片段 (large fragment of DNA polymerase I) DNA聚合酶I用枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)裂解后产生的大片段，这个片段也称为Klenow片段（Klenow fragment）。 ; Klenow片段的主要用途有： (1) 补齐双链DNA的3ˊ末端。 (2) 通过补齐3ˊ端，使3ˊ末端标记。 5ˊ-G-OH Klenow 5ˊ-GTT*A*A-OH 3ˊ-CAATT-OH d*ATP,dTTP 3ˊ-CAA T T-OH (3) 在cDNA克隆中，第二股链的合成。 (4) DNA序列分析。;3. 逆转录酶（reverse transcriptase） 一种RNA依赖的DNA聚合酶，即以RNA为模板合成DNA， 合成方向为5ˊ→3ˊ延伸，无3ˊ→5ˊ外切酶活性。 ;Date;4. T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase） 催化双链DNA一端3ˊ-OH与另一双链DNA的5ˊ端磷酸根形成3ˊ→5ˊ磷酸二酯键，使具有相同黏性末端或平端的DNA两端连接起来。 ;Date;5. 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase） 能去除DNA或RNA 5ˊ端的磷酸根。制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身连接，提高重组效率。 ;Date;6. 末端脱氧核苷酸转移酶 （terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT ); 第二节 基因克隆的载体 ;一、常用的克隆载体 (一)质粒（plasmid） 是存在于多数细菌和某些真核生物染色体外的双链环状的DNA分子。一般只能容纳小于10 kb的外源DNA片段。 ;作为克隆载体的质粒应具备下列特点： （1）分子量相对较小，能在细菌内稳定存 在，有较高的拷贝数。;Date;Date;Date;(二)λ噬菌体 噬菌体(bacteriophage, phage)是感染细菌的病毒， 用作克隆载体的噬菌体有两种。 λ噬菌体 M13噬菌体 ;;;;(三)黏性质粒（cosmid） 是由λ噬菌体的黏性末端（cos区）与质粒重新构建的载体，为双链、环状DNA。其克隆容量可达40～50 kb。 ;(四) M13噬菌体 (M13 phage) 一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体。 感染细菌后，经过复制转变为双链的复制型（RF）。复制型M13可用作克隆载体。 ;Date;(五) 病毒载体 逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、EB病毒等作为基因转移的载体。多数病毒载体均已质粒化，病毒载体