蛋白质类药物分析 课件.ppt

2、质谱法 特点：具有准确、快速，重复性好，测定范围广等特点 适用范围：Mr＜10kD的Pr和多肽 Multiply charged ion peaks of myoglobin analyzed by ESI-ion trap mass spectrometer （六）二级结构测定 通常采用圆二色光谱(CD）测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。 mdeg Wavelength (nm) 200 220 The far-UV CD spectra were obtained before and after 276 nm light continuous exc. (0.5 h, 1 h, 1.5 h, 2.5 h, 3.5 h, and 7 h) of insulin in solution. There is a progressive loss of ellipticity signal with 276 nm exc. time at 195, 209 and 222 nm. Circular dichroism spectrometry in the ultraviolet wavelength region (UV-CD) of MBP-cytochrome b fusion protein in different detergent solutions. （七）二硫键定位 Theoretical S. aureus protease fragmentation of human insulin (●，residues of glutamine) 二硫键和巯基与蛋白质的生物活性密切相关。对二硫键的分析虽然在常检定项目中没有规定，但在质量研究中应尽可能分析清楚 有些产品二硫键较多，用现有的技术完全分析清楚很困难，可以结合其他项目的检测，如比活性等进行有效的质量控制 方法：碘代乙酰胺保护游离巯基，胃蛋白酶水解样品（切点多，酸性环境下防止二硫键交换），将所得肽段用对角线电泳分离 对角线电泳 蛋白质寡糖可以上调、下调或抑制糖蛋白的生物活性，影响蛋白质代谢命运、稳定性或溶解性 通过基因工程方法将一种糖蛋白在不同细胞中表达，可以导致生产不同类型的糖蛋白；即使在相同的细胞类型中，也可能会出现糖形成时由于一些寡糖的精细结构不同和普通寡糖产生的相对频率不同而产生截然不同的糖蛋白 （八）糖基化分析 糖基化分析内容： 糖基化位点、分子量、糖组成、连接方式 分析方法： 酶解、质谱、LC/MS、GC/MS CE analysis of IgG glycans. Lower trace: High resolution analysis of APTS derivatized IgG glycans, Upper trace: CE separation of APTS derivatized maltooligosaccharide ladder Tryptic peptide mapping of recombinant human erythropoietin in phosphate buffer, pH 2.5, with 100 mM heptanesulfonic acid by capillary electrophoresis. The maps from two different expression systems are shown, the upper without glycosylation (E. coli), the lower with (Chinese Hamster Ovary cells) but subsequently treated with N-glycanase. 三、检查 检查内容：纯度；相关杂质（产品相关、工艺过程相关） （一）多肽类药物 （二）蛋白质类药物 （一）多肽类药物 氨基酸比值：通过氨基酸分析法测定其各种氨基酸比值 有关物质：合成过程中产生的肽类杂质、降解杂质、聚合物和光学杂质，采用梯度洗脱RP HPLC或毛细管电泳法 醋酸：多肽类药物多为其醋酸盐，采用RP HPLC （二）蛋白质类药物 有关物质：相关Pr杂质，采用梯度洗脱RP HPLC 高分子蛋白质：高分子聚合物，采用分子排阻色谱法 生物活性：生物检定 1、纯度检查 样品：原液 方法：必须采用两种方法测定（非还原SDS和HPLC） 标准：纯度均达到95%或98%以上 （1）非还原SDS法（Chp附录ⅣC） SDS：据分子大小分离 样品处理：样品不加β-ME或DTT（二硫键未打开，反映单体、二聚体和多聚体情况） 染色方法与上样量：银染，5μg（检测限为1-10 ng）；考马斯亮蓝R