讲义基因诊断 课件.ppt

PCR/单链构象多态性分析（SSCP） PCR产物变性后， 经聚丙烯酰胺凝胶电泳， 正常基因和变异基因的迁移位置不同， 可分析确定致病基因的存在。 四、限制酶酶谱分析 基因突变导致酶切位点的丢失或相对位置发生改变 以此酶消化待测DNA和野生型对照DNA，通过比较二者的酶切片段，的长度，数量上的差异就可判断待测DNA的突变情况。 ㈤ DNA序列测定 是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法。不仅可确定突变的部位，而且可确定突变的性质。 分子克隆到T载体上，或直接对扩增产物进行测序。 DNA芯片(DNA chip) cDNA芯片(cDNA chip) 是指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上 。 （六） DNA芯片技术 基因芯片(gene chip) 目 录 二、基因诊断的基本方法 基因变异致病的类型： 内源基因的变异 基因结构的突变 点突变、插入、缺失、重排、异位、 基因扩增， 基因表达异常 mRNA剪接异常 外源基因的插入 ㈠基因突变的诊断 点突变的诊断 ①诊断已知的点突变 （PCR/ASO） ASO allele specific oligonucleotide 等位基因特异性寡核苷酸探针 突变碱基置探针中央 控制杂交条件 结果分析： A T C G 探针定位 正常 C T (纯合子) C T C G C A (杂合子) （新突变） （新突变） ②诊断未知的突变 PCR/SSCP/测序 DNA芯片技术（大规模未知突变的筛查） N 4×n 1.28平方cm 16000个寡核苷酸 2 .大片段丢失或插入的诊断 外侧确定有无缺失及缺失片断的相对大小 内侧确定缺失部位. ㈡多态性连锁分析 DNA多态性——在同种生物不同个体的基因组中，常存在一些不影响基因功能的DNA顺序变异，称为DNA多态性（polymorphism） DNA多态性标记 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP) 短串联重复序列（short tandom repeat, STR） 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP） 限制性片段长度多态性（RFLP） DNA→酶切→Southern杂交分析 DNA→PCR →酶切→电泳分析 由串联重复顺序导致的长度多态性 STR含有较高的信息量且容易检测 STR由2~6个核苷酸串联重复组成，微卫星DNA ㈢基因表达异常的诊断 mRNA的相对定量分析 斑点杂交 RT—PCR mRNA的绝对定量分析 RT—PCR/竞争性PCR(50bp标准cDNA 已知浓度) mRNA长度分析 Northern杂交/ RT—PCR产物电泳 ㈣ 外源DNA检测 核酸分子杂交 PCR技术 许多病原体的基因结构已被阐明，设计基因特异性探针，或合成特异的寡核苷酸引物，可直接从临床标本中检测病原体基因组核酸(DNA或RNA)的存在，即可早期、快速、敏感、特异地确定病原体的存在。 第二节 基因诊断的应用 1、遗传疾病 2、感染性疾病 （1）病毒性感染 （2）细菌性感染 （3）寄生虫 （4）其他 3、恶性肿瘤 4、法医学中的应用 （1）DNA指纹分析（DNA fingerprinting） （2）短串联重复多态性分析 　　（short tandem repeat，STR） 一、遗传性疾病 Hb D Punjab血红蛋白病 121位co密码子由GAA突变位CAA，该突变导致限制酶EcoR1位点消失（GAATTC） 镰刀型红细胞贫血症： 第六位密码由GAG突变成GTG,导致不能被OxaN1酶切 × MstⅡ酶切位点(GCTNAGG) 5′ 3′ 正常基因 5′ 3′ 突变基因 1.15kb 1.35kb 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 OxaN1 阿尔茨海默症防治