试验一质粒DNA的提取1pps.PPT

* * 实验一 质粒DNA的提取——碱裂解法 一 实验目的 了解质粒的特性及其在基因工程中的应用。 掌握碱裂解法分离质粒DNA的基本原理和操作要点。 质粒是一种染色体外能够稳定遗传的因子，具有双链共价闭环结构的DNA分子。是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。 常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等 质粒的复制：严紧型复制（1-n个） 　　　　　　　 松弛型复制（20个以上） 培养细菌使质粒扩增 收集和裂解细菌 分离和纯化质粒DNA 共价闭环DNA（cccDNA） 线状DNA（lcDNA） 开环DNA（ocDNA） 三个基本步骤 质粒存的形态 二 实验原理 碱裂解法利用宿主菌巨大线状染色体DNA与相对较小的闭环双链质粒DNA的结构的差异来提取质粒DNA。 碱变性DNA时，线状基因组DNA变性充分而质粒DNA处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分开。当去除变性条件时（酸中和），质粒DNA迅速准确配置重新形成完全天然超螺旋状分子，而难于复性的长链线状的基因组DNA则与破裂的细胞壁、细菌蛋白相互缠绕成大型复合物，被SDS包盖，当K+取代Na+时这些复合物会从溶液中沉淀下来，附在细胞碎片上一起被离心除去。 接含质粒的单菌落于3ml LB Amp+液体培养基中 ? 370C，190rpm振荡培养过夜 ? 取2.0mL菌液入2.0ml的dorf管中 5000rpm、离心5min，弃上清，收集菌体 ? 200uL溶液I+2uLRNA酶悬浮菌体（充分混匀），冰上静置5min ? 加入400uL溶液II（轻轻混匀），室温静置5min裂解菌体 ? 加入300uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置5min质粒DNA复性 三 实验步骤 ? 4℃ ，9000rpm，离心15min，取700μL（注不要吸到沉淀物）上清到一新管 ? 加700μL的氯仿：异戊醇（混匀），冰上静置5min ? 4℃ ，9000rpm，离心15min，取500μL（注不要吸到沉淀物）上清到一新管 ? 加1.0mL无水乙醇（充分混匀），-20℃ 放置20min ? 4℃ ，9000rpm，离心15min ，弃上清 ? 加入500μL 70%乙醇，将沉淀悬起 ? 4℃，9000 r/min离心5min，弃上清（用软纸将管内乙醇吸干）即可。 溶液I 　　作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活 溶液II 　　作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。 溶液III 　　作用：酸性下质粒DNA复性，变性蛋白－SDS＋线性DNA沉淀。 氯仿：异戊醇 　作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫） 无水乙醇 作用：除去DNA水化层，使DNA沉淀 TE缓冲液 作用：溶解DNA 四 实验结果 五 注意事项 操作过程必需缓和，不能剧烈振荡。 六 习 题 实验中溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ各起什么作用？实验中分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因。 简要叙述酚氯仿抽提ＤＮＡ体系后出现的现象及其成因。 超螺旋结构DNA 从上而下分别为同种质粒的三种不同构象： 开环状DNA 线状DNA 超螺旋状DNA。