试验五禽流感血清学诊断.PPT

实验课内容 1 2 3 4 5 6 7 禽流感概述 病原分离 实验原理 器材与试剂 病原分离 接种鸡胚 HA-HI 禽流感病毒（AIV）感染禽后可引起各种综合征，从无临诊症状感染到呼吸道疾病和产蛋下降，到死亡率接近100%的严重全身性疾病。 迄今为止，高致病性AIV都是H5和H7血清亚型，而所有其它亚型毒株对禽类均为低致病性（MP）。 病禽和带毒禽是主要传染源。鸭、鹅等和野生水禽在本病传播中起重要作用，候鸟也可能起一定作用。感染途径为呼吸道和消化道。本病虽无明显季节性，但常常以冬春季多发。 流行病学 ?低致病性禽流感（MPAI） MPAI病毒在野禽中大多数不产生临诊症状。 鸡和火鸡的表现为呼吸、消化、泌尿和繁殖器官的异常。 ?高致病性禽流感（HPAI） 急性败血性，呼吸困难、腹泻、高热、神经症状。 发病率和死亡率很高（50～90%），有的鸡群可达100%。 临床症状 因宿主种类和免疫状态、病毒致病性等不同而有很大差异。 ? MPAI 病理变化主要在呼吸道，尤其是窦的损害，以卡他、纤维性、脓性或纤维脓性炎症为特征。 ? HPAI 在内脏器官和皮肤有各种水肿、出血和坏死，最急性型可能无大体病理变化。 病理变化 有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。 实验原理 掌握HA和HI试验的基本操作技术，了解其实用价值。 目的与要求 96孔“V”形微量反应板,100 uL加样器，枪头。 2. 生理盐水，0.5%鸡红细胞悬液，禽流感病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），禽流感阳性血清，被检鸡血清。 器材与试剂 在感染初期或发病急性期从死禽或活禽采取。 死禽采集气管、肺、肝、肾、脾、泄殖腔等组织样品。组织样品先用肉汤培养基或PBS制成10~20（W/V）的悬液，1000 r离心10 min，取上清液作为试验样品。为防止细菌污染，应加入以下抗生素：青霉素2 000 μg，链霉素2000g，卡那霉素1000 g（每毫升培养液中所含）。样品离心后也可用细菌过滤器过滤除菌。 病毒分离 病毒分离 活禽用大小不等的灭菌棉拭子涂擦喉头、气管或泄殖腔，然后将带有分泌物的棉拭子放入每毫升含有1000 μg青霉、2000 μg链霉素pH7.2~7.6的肉汤中，无肉汤时可用Hanks液或25%~50%的甘油盐水。小珍禽用拭子取样易造成损伤可取而代之以采集新鲜粪便。 将棉拭子充分捻动、拧干后除去拭子，样品液经1000 r离心10 min，取上清液作为接种材料。 常用9～10日龄的鸡胚，每份病料至少注入5个鸡胚，接种于绒毛尿囊膜或尿囊内，操作方法如下。 1．照蛋，划出气室位置，在鸡胚胎面观看胚胎活动，选择无大血管处标一记号。 2．在气室顶部和标记处用碘酊和酒精消毒，并各钻一小孔。 3．用较干的碘酊棉球涂布小孔。 接种鸡胚 4．用1毫升注射器吸取上述处理过的材料，插入小孔内约3mm，缓缓注入0.1～0.2毫升，拔出针头。 5．用融化石腊封口，在蛋壳上标明日期。 6．置37℃温箱培养，每天照蛋二次，至全部或大部分鸡胚发生死亡为止（24小时内死亡的胚弃之）。 7．将死胚收藏于4℃冰箱内，气室向上，6～24小时获尿囊液。 接种鸡胚 1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50 μL生理盐水。 2. 于左侧第1孔加50 μL病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸50 μL至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50 μL；第12孔为红细胞对照。 3. 自右至左依次向各孔加入0.5%鸡红细胞悬液50 μL，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果。 血凝（HA）试验 96孔板孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 对照 生 理盐水 50 50 50 …….. 50 50 50 病 毒 50 50 50 …….. 50 50 红细胞 50 50 50 …….. 50 50 50 病毒稀释倍数 1：2 1：4 1：8 …….. 1:1024 1:2048 结果判定 # # # # # # # + + ﹣ ﹣ ﹣ 弃去50μL 以100%凝集病毒最大稀释孔为该病毒的凝集价 血凝（HA）试验 　4.结果判定：从静置后10 min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集