基因敲除新技术介绍.ppt

ZFN 技术原理;ZFN 技术;崭新的技术 - TALEN 经典的挑战 – 染色体DNA序列的人工编辑修改 （点）突变：Silent；Missense； Nonsense；Frame shift （基因敲除，Knockout） 片段删除 片段插入 目的与用途：生物模型；表达工具；基因治疗 ;靶向基因技术;TALEN技术;;TALEN (TALE+FOK I) 表达质粒对 ;TALEN介导的同源重组;2011年8月， Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》 一篇大鼠 《Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs》 两篇斑马鱼 《Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs》 《Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs》 一篇综述 《Move over ZFN》 ;TALEN靶向（基因敲除）技术基本流程;; TAL的核酸识别单元为34aa模块中的双连氨基酸（RVD） RVD??A、G、C、T有恒定的对应关系，即NI识别A，NG识别T，HD识别C，NN识别G，非常简单明确 欲使TALEN特异识别某一核酸序列（靶点），只须按照靶点序列将相应TAL单元（14 -18个）串联克隆即可。;;;步骤二：TALEN表达质粒构建;将靶点识别模块克隆入真核表达载体，得到Talen质粒对 靶点识别模块串接成功后需克隆入真核表达载体中。此真核表达载体含有TAL的其它必需结构域并在C端融合有FokI序列。 目前，TALEN系统利用FokI的内切酶活性打断目标基因。因FokI需形成2聚体方能发挥活性，在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻（间隔17碱基）的靶序列（14 - 18个碱基）分别进行TAL识别模块构建。 ;步骤三. 将TALEN质粒对共转入细胞中实现靶基因敲除 TALEN质粒对共转入细胞后，其表达的融合蛋白即可分别找到其DNA靶位点并与靶位点特异结合。此时，两个TALEN融合蛋白中的FokI功能域形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，于两个靶位点之间打断目标基因。;内切酶的切割诱发DNA损伤修复机制（nonhomologous end-joining，NHEJ）。由于在此修过程中总是有一定的错误率存在。在修复中发生移码突变错误的个体即形成目标基因敲除突变体。 ;PCR – 酶切法 利用靶点设计时挑选的，位于相邻靶位点之间的特异性内切酶位点，进行PCR产物酶切鉴定。 当左右靶点之间没有合适的酶切位点时可使用CEL-I核酸酶检测。 经验规律：= 2%可用，=10%很好;TALEN切割效率检测;突变体筛选;基本工具质粒;怎样做TALEN;怎样做TALEN;TALEN技术成功率影响因素;TALE技术应用范围;TALEN的植物应用;TALEN与主要类同技术比较;基因组精密工程;;Biotechnology: Rewriting a genome Nature?495,?50–51?(07 March 2013)?doi:10.1038/495050a;1 CRISPR-Cas概述;1 CRISPR-Cas概述;CRISPR-Cas主要由两部分组成：;1.1 CRISPR结构;1.1 CRISPR结构;1.2 Cas家族;2 CRISPR-Cas系统的发现;2 CRISPR-Cas系统的发现;2 CRISPR-Cas系统的发现;2 CRISPR-Cas系统的发现;2 CRISPR-Cas系统靶向要求;2 CRISPR-Cas系统靶向要求;2 CRISPR-Cas系统靶向要求;3 CRISPR-Cas系统介导基因修饰;3.1 dual-RNA：Cas介导编辑模板替换;3.1 dual-RNA：Cas介导编辑模板替换;3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰;3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰;3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰;3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰; 2013年2月15日在《science》上发表的《Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems》一文中，作者利用一个包含两个靶向不同基因的space