细胞划痕试验Transwell.PPT

肿瘤侵袭、转移实验技术 首都医科大学 2015.11 目录 一、概述 二、细胞划痕实验 三、Transwell 四、裸鼠尾静脉注射实验 五、总结 一、概述 肿瘤侵袭和转移 体外 体内 细胞划痕实验 Transwell 裸鼠尾静脉注射 二、细胞划痕实验 细胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法，实验成本低，可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的迁移能力。 实验优点： 1.在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程。 2.适合研究细胞与胞外基质（ECM）、细胞与细胞之间相互作用引起的细胞迁移。 3.与包括活细胞成像在内的显微镜系统兼容，可用于分析细胞间的相互作用。 4.研究细胞迁移的体外实验中最简单的方法。 二、细胞划痕实验 实验材料： 细胞样品 仪器、耗材：6孔板 marker笔 直尺 枪头 试剂、试剂盒：无血清培养基、PBS 二、细胞划痕实验 1.所有能灭菌的器械都要灭菌 2.超净工作台 紫外线消毒30min 注：需要灭菌的器材包括——离心管、吸管筒、移液枪、枪头等 二、细胞划痕实验 4.每孔加入5X105个细胞并培养约24h 注：1.数量以过夜贴壁能铺满为宜，适当调整 2.数量少时可培养一段时间至铺满板底 （3. 6孔板背面画线5-6条） 二、细胞划痕实验 5.用1ml枪头垂直于孔板和线制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致 注：.人工枪头制造划痕难以保证划痕宽度的一致性，影响实验结果，这也是该方法最大的缺陷 二、细胞划痕实验 6.吸掉旧培养基，用无菌PBS冲洗细胞3次，去除划下的细胞后，再加入无血清培养基，根据需要设加实验组、对照组。 注：冲洗时温柔，贴壁加入，避免冲掉单层细胞 二、细胞划痕实验 7.放入37度5%CO2培养箱，培养。按0，（6），12，24小时取样，拍照。 8.计算、比较、分析 ①image J 软件计算每个视野的划痕面积 ②/en/ 二、细胞划痕实验 新：德国IBIDI（易必迪）技术 1.准备细胞，培养液，culture Insert。 2.将细胞接种于Dish中间的Insert，培养。 3.细胞长满Insert 区域后用镊子移除Insert即可产生500μm宽度的划痕。 4.每隔4-6小时拍照记录。 5.根据收集图片数据分析实验结果 二、细胞划痕实验 谈几点问题： 1.细胞的选择：一般适用于上皮，纤维样细胞系 a.本身有迁移能力，且较强。 b.有极性，方便测量，观察。 c.对无血清有较强的忍受力。 2.观察的时间：一般为0、6、12、24h a.时间太久，无血清，易死亡，相对坚强 b.时间太久，细胞繁殖，假阳性 二、细胞划痕实验 三、Transwell Transwell是一种应用Transwell 小室来探究细胞共培养 、细胞趋化 、细胞迁移 、细胞侵袭等的问题的实验技术。 三、Transwell ①Transwell小室：常用8.0um膜，铺胶130rmb、不铺胶40rmb，可重复利用 ②上层培养液：无血清培养基，为维持渗透压，需加入0.05%-0.2% BSA ③ 细胞：有侵袭能力细胞 先撤血清让细胞饥饿12－24h，再进行实验 材料准备及说明： 三、Transwell ④ 基质胶：常用的是人工重构基底膜材料Matrigel ⑤ 下层培养液：含5%－10% FBS的培养基， 也可用趋化因子 ⑥ 细胞培养板：6孔板、12孔板、24孔板等， 以24孔最常用 材料准备及说明： 三、Transwell 1.Transwell小室制备 ①包被基底膜：用50mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干 ② 水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37℃，30min。 三、Transwell 2.取细胞悬液加入Transwell小室，24孔板小室一般200μl。细胞密度为1－10×105个. 3.24孔板下室一般加入500μl含FBS或趋化因子的培养基。 三、细胞划痕实验 4.培养细胞：常规培养48h，具体调整 5.结果测定： ①直接测定：细胞染色，镜下计数 ②间接测定：MTT法、荧光试剂检测、结晶紫染色 问：某药可抑细胞侵袭，24h后可抑制细胞增殖，可以培养36h看结果吗？ 三、Transwell 直接观察： ① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞 ② 染色：推荐采用0.1%结晶紫固定染色。 ③ 细胞计数