分子生物学常用技术在中医药研究中的应用实验课rtcr.ppt

* * 实验 20 RT-PCR 目 的 观察某一特定基因转录量的变化。反转录酶聚合酶链式反应（RT-PCR）以其灵敏度高，要求样品量少，实验周期短而倍受青睐。有人将RT-PCR实验结果与Northern blot结果等进行比较分析，发现两种不同方法所得到的实验结果相一致。 类似的有Northern blot、原位杂交，甚至原位PCR等。 原 理 首先，以目的基因mRNA为模板，利用反转录酶的活性，合成对应的cDNA。然后在模板cDNA、目的基因特异引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依靠Taq DNA聚合酶的酶促反应，通过变性、退火、延伸的反复循环中，扩增出大量特异的目的DNA产物。最后，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，显色，并进行图象分析。 实验准备 实验步骤 1．分光光度计检测RNA的浓度与纯度 各样品总RNA取5ul加入1ml水中测OD值，当OD260/OD280≥1.8时，方可使用。根据以下公式计算RNA的浓度： 样品总RNA含量（ug/ul）=OD260×稀释倍数×40/1000 2．反转录 水 7ul dNTP（each 10mM） 2ul 5×buffer 4ul DTT（100mM） 1ul RNAsin（40U/ul） 1ul 随机引物（100uM） 1ul 组织总RNA（2ug） 2ul 65℃ 5min，快速插入冰水中，冰上加入： RNAsin（40U/ul） 1ul M-MLV反转录酶（200U/ul）1ul 37℃ 60min，65℃ 5min（灭活逆转录酶）。 -20℃保存。 3．PCR扩增 水 20ul dNTP（each 0.5mM） 4ul 10×buffer 4ul MgCl2 （25mM） 4ul 上游引物（4uM） 2ul 下游引物（4uM） 2ul 反转录产物 4ul Taq DNA聚合酶（5U/ul） 0.4ul 石腊油 25ul PCR反应条件为94℃ 3min； 94℃ 40s，55℃ 1min，72℃ 1min，30个循环； 72℃ 5min→4℃ 保存。 4．电泳 取PCR产物20ul与上样缓冲液4ul混匀后，上样于1.6%的琼脂糖凝胶中，其中一孔加DNA marker，80V电压，电泳1小时。紫外透射仪下查看，并拍照。 5．图象处理 取电泳凝胶的底片，用KS400型图象分析系统进行光密度扫描，以目的基因光密度值与对应内参基因光密度值的比值作为该样品中目的基因的相对转录量。最后以目的基因的相对转录量为参数进行半定量统计分析。 实验结果 在紫外透射仪上，琼脂糖凝胶于DNA marker相应分子量的位置，可见清晰的DNA条带。 通过光密度值与对应内参基因条带的光密度值的比值，可作为该基因的相对转录量进行半定量分析。 注意事项 1．该实验使用的样品为RNA，因此在反转录过程中，要特别注意防止RNA酶的污染。为此在反转录过程中除使用RNA酶抑制剂外，所使用的枪头、试管，水等均建议用DEPC处理。 2．在做2个样品以上的实验时，不管是反转录反应还是PCR反应都应先配置试剂的共同混合物（共同混合物包括RNase Free dH2O，Buffer，dNTP，Taq酶，MgCl2等），然后分装到每个反应管中，以保证各试管不同试剂的用量一致，减少实验误差，同时还能减少试剂的损失。 3．取反转录酶等酶类时，要轻轻混匀，避免起气泡。分取之前要轻轻地离心收集到反应管底部，因其粘度高，所以要慢慢地分取。 4．为防止RNA分解，应避免多次冻融，应将RNA少量分装后保存于-70℃中。 5．最佳的PCR条件，因PCR扩增仪的不同、试管不同而有所不同，所以最好先用内参基因作PCR反应，以摸索最佳的PCR条件。 6．目的基因PCR引物的选取常常是实验成功与否的关键。一般来说，引物的长度在18～30个碱基之间，引物过短会使特异性降低；引物碱基尽可能随机分布，（G+C）含量在45～55%左右；引物内部不应形成二级结构，两个引物之间不应有互补链存在；引物3’末端的末位碱基最好选C、G而不选A、T。 7．反转录反应可选择随机引物（Random mers）、Oligo dT Primer和目的基因的下游引物三者之中的任一种。但它们之间有细微的差异，其中随机引物适合于链比较长或具有发夹结构