分子生物学常用技术在中医药研究中的应用实验课绪论.ppt

* 以上研究揭示出单一细胞内生物调控现象的混沌复杂，而位于组织和机体中的细胞还受到周边细胞、组织、其它系统的影响，因而变化就更复杂、更微妙，这就在细胞、分子水平印证了中医学的整体观、恒动观，丰富了中医学的整体观、恒动观。 澳大利亚的一研究发现，刺激下丘脑某一特定核团可以促使GnRH的释放，但是随着研究的深入，发现不同实验动物，对相同的刺激反应表现却不同。这一结果令人联想到中医的体质学说和证的变化。延伸出去，这些变化，就有可能是体质、证在基因、细胞、组织层次的表现，而辨证论治有可能在改变这些环节而发生作用。 那么，是不是非要等到别人研究清楚，我们再去后悔没有投入这样的中医基础研究呢？ * 因此，中医延缓衰老的深入研究要求采用以上的这些分子生物学技术，推而广之，其他中医药领域的研究也要求采用以上这些分子生物学技术，在这些研究的基础上，结合临床有效中药复方的疗效优势，给予进一步干预研究，了解作用于那些基因、调整了那些蛋白产物，与已知中西药的作用异同，等等。使研究深入下去。如此，可以极大地提高中医药研究的效率、研究的深度、研究的可靠性、研究的竞争性。这样的研究不仅将有利于进一步揭示中药复方的作用机制，丰富中医藏象学说、辨证论治理论、治则治法学说，以及中药新药的开发、中药产品的升级换代、加强中医药产业国际的竞争力；还将发现新的生命及其调控现象，拓展人类对生命学科的认识。因此，加大分子生物学方法技术在中医药研究中的应用，是新世纪发展中医学的重要途径。 * 三、中医药研究常用分子生物学技术 综合目前中医药研究中常用的分子生物学技术，以及将有可能普遍涉及到的技术，主要包括以下内容： 1．中医药对基因组（DNA）作用的研究 人类基因组计划的人类基因测序工作已经完成。一些实验动物、植物，包括中药植物的测序工作正在展开，或计划展开。鉴于中医药研究也自然会广泛投入这样的研究。其主要方法包括基因组DNA提取、Southern blot（观察DNA的变化，方法大体接近以后我们要介绍的Northern blot）、PCR技术、点突变PCR（研究DNA的功能及其意义）、DNA测序等。 * 2．中医药对某个已知基因转录（mRNA）水平调整作用的研究 主要包括提取总RNA，做Northern blot或RTPCR。 以上实验涉及到多项分子生物学常用技术和方法，包括：重组质粒、转化宿主细菌、筛选阳性克隆、扩增细菌、从细菌中制备已扩增了的DNA、利用限制性内切酶切开重组插入的DNA片段和载体、电泳分离插入DNA片段和载体、回收插入并放大的DNA基因片段、标记探针，以及制备组织或细胞的RNA，RNA电泳、把RNA 转移到硝酸纤维素膜上（印迹转移）、固定，Northern杂交、放射自显影，等等。本课程将会详细介绍这些内容和实验操作。 * 3．中医药对多个已知基因转录（mRNA）水平调整作用的研究 cDNA列阵（cDNA Array）和基因芯片（Micro Array）这些在九十年代迅速发展起来的技术效率最高。这些实验所提供的信息量大，一个实验，可以观察多至数万个基因变化，给研究复杂的中医药调控机制和变化提供了强有力的武器。 * 4．中医药对广泛未知基因差异转录（mRNA）作用的研究 该实验主要采用DDPCR技术。相关的还有cDNA库建立、基因全序列cDNA库筛选，RACE PCR技术。 5．观察中医药对某一已知蛋白表达水平的调整作用 比较常用的方法是ELISA技术、免疫组化和Western blot等技术。还有单克隆抗体制备技术。 * 6．观察中医药对若干已知或未知蛋白表达水平的调整作用 蛋白双向电泳和蛋白芯片技术，以及后续的质谱技术。 7．中医药对某基因转录调控的研究 包括RNAi技术、Footprint技术、凝胶阻滞实验、报道基因技术、功能基因插入哺乳类细胞表达载体技术、基因转移技术，等等。 以上5-7的内容，我们会给大家介绍。 * 四、本课程的教学安排 包括两个方面，而重在基本技术的操作和培训： （1）理论介绍性的：如PCR技术，DNA测序，cDNA列阵（cDNA Array）和基因芯片（Micro Array），DDPCR技术，RACE PCR技术等，及其在中医药研究中的应用。 （2）基本实验训练的：如重组质粒、转化宿主细菌、筛选阳性克隆、扩增细菌、从细菌中制备已扩增了的DNA、利用限制性内切酶切开重组插入的DNA片段和载体、电泳分离插入DNA片段和载体、回收插入并放大的DNA基因片段，以及制备组织或细胞的RNA，RTPCR等。 * 理论课教室：7207；实验课教室：4115 课次 课堂讲授 实验见习 第一次 5/17 绪 论；重组质粒的方法与原理；质粒转化大肠杆菌的方法与原理。 重组质粒实验；质粒转化大肠杆菌实验。 第二次 5/24 阳性单菌