分子生物学常用技术在中医药研究中的应用实验课重组质粒.ppt

* * 实验 1 重组质粒 目 的 1．放大某一基因片段，用于探针、基因功能检测、报道基因研究等。方法是：把某一DNA片段插入到相应的载体（比如质粒、噬菌体、哺乳类细胞表达载体等），给予扩增，用以标记探针、测序、cDNA库建立、基因功能检测等多种分子生物学实验。因此重组质粒就成为中医药实验研究中最为常规的实验。 通常，扩增目的DNA主要借助两类方法，即PCR技术和载体重组技术，鉴于PCR技术受到酶的性能和方法学等多方面的限制，某些DNA和超过一定长度DNA的扩增会有困难，所以载体重组技术倍受青睐。 2．DD-PCR产物的克隆和测序。 3．RACE-PCR产物的克隆和测序。 4．构建基因库、cDNA库，等。 5．纯化基因片段。 关于载体——质粒 质粒是一类双链、闭环的DNA分子，存在于细菌体中，独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。通过改造，实验室常用质粒被赋予了以下几种特性： （1）含有多克隆位点区域，可方便地插入目的DNA片段。 （2）对细菌的可转移性，即在实验中，可将质粒诱导入细菌。 （3）选择标记。常用的有抗生素抗性基因。这样，一旦质粒进入细菌，便可使该细菌对相应的抗生素产生抵抗能力，在含这一抗生素的琼脂平板上传代。 （4）在细菌体内可获得较高的拷贝数，例如一种叫pUC的质粒，在单一细菌体中的拷贝数可达500～700个。因此，质粒已成为分子生物学中使用最为广泛的载体。 本实验所用的质粒是pUC19，全长2686个碱基对（bp），在质粒的 10～110 bp段为多克隆位点区域，含有 Pst I、EcoR I、Kpn I、Sma I、Hind III、BamH I、Sac I等多种限制性内切酶的位点。 常用载体 1．质粒 2．噬菌体 3．哺乳动物细胞载体（质粒） 4．酵母载体 5．穿梭载体 半乳糖苷酶的蓝/白斑筛选系统 在质粒中含有LacZ基因的α-肽的序列，当无外源DNA片段插入时，质粒表达α-肽，它与宿主菌的Lac ZM15基因的产物互补，产生有活性的β-半乳糖苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG存在的情况下，菌落呈蓝色（质粒自身环化）；外源基因插入后，肽基因阅读框架被破坏，细菌内无半乳糖苷酶活性存在，菌落呈白色（阳性克隆） 。 原理 采用由Hind III切割开的pUC19质粒，以及由Hind III切割PCR片段，用T4噬菌体DNA连接酶将PCR片段与切割开质粒DNA片段重新连接成一个环状的DNA分子，即把目的基因DNA插入质粒DNA，实现质粒重组。 三种不同的酶切方式 EcoR I ↓ 5...GAATTC...3 → 5...G AATTC...3 3...CTTAAG...5 3...CTTAA G...5 Pst I ↓ 5...CTGCAG...3 → 5...CTGCA G...3 3...GACGTC...5 3...G ACGTC...5 Sma I ↓ 5...CCCGGG...3 → 5...CCC GGG...3 3...GGGCCC...5 3...GGG CCC...5 实验准备 （参考教材） 实验步骤 标记试管（内容、日期），插入碎冰，依次加入： H2O 4 ul 50ng/ul PCR产物（待插入DNA） 2 ul 50ng/ul pUC19质粒DNA（载体DNA）2 ul 盖上盖，放入45℃水浴×5min，插入冰内，开盖，再加入： 10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液 1ul T4噬菌体DNA连接酶 1ul 指拨混匀，用离心机将管壁溶液甩至管底，16℃ 过夜。 实验结果 得到10ul的重组质粒，可用于转化大肠杆菌。 注意事项 1．当采用其它质粒和插入片段时，可以参照本实验采用的浓度和用量。鉴于不同长度的插入片段、不同末端的载体和片段，两者的最终浓度在不同的实验室有各自的经验，浓度会有一些变化，操作时可以参考。 2．水浴温度。鉴于非中央空调实验室室温会随四季、昼夜波动，往往高于16℃。因此，16℃恒温水浴通常放在4℃冷库（或4℃冰箱）之中。使用前