分子生物学常用技术在中医药研究中的应用实验课质粒转化大肠杆菌.ppt

* * 实验 2 质粒转化大肠杆菌 目 的 1．重组质粒的鉴定 当质粒的重组或其它载体重组后，通常会发生质粒的重组失败，包括质粒的自身环化。因而要求进行筛选，把重组成功的质粒找出来。 在目前常用的质粒和其它载体中含有相应的抗生素抗性基因，一旦重组成功，或者不含插入片段的质粒自身环化，抗生素抗性基因表达，被转化的大肠杆菌便具备抵抗相应抗生素的能力，可以在含该抗生素的培养基上生长传代。不然，假如重组失败，大肠杆菌便不能抵抗该抗生素而死亡。 2．为扩增质粒和其它载体作准备 由于大肠杆菌繁殖快，在适宜的条件下繁殖一代仅需要20～30分钟，而且常用质粒可以在大肠杆菌中增殖达到几百个拷贝。因此，通过对转化成功的大肠杆菌培养，可以在短时内极大地扩增目的质粒。 * 作为分子生物学用大肠杆菌，是经过实验室改造过的工程菌。 原 理 本实验通过CaCl2对特定的大肠杆菌处理，制备感受态的细菌。这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA，如一些插入目的DNA片段的重组质粒，产生5×106～2×107 个转化的菌落。 当质粒与这些大肠杆菌混合后，质粒粘附在大肠杆菌的表面，在42℃的温度时，大肠杆菌出现热休克，质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。随后，加入LB培养液，于37℃振动培养可使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因，提高转化效率。转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代，形成菌落。 实验准备 （参考教材） 实验步骤 自-70℃冰箱中取出受感态大肠杆菌，插入湿冰中溶解约5～15分钟，轻轻混匀。吸取50ul移入1.5ml管，并立刻将细菌放回-70℃冰箱。 细菌 50 ul DNA 5 ul 轻轻混匀，静置冰上30分钟。 于42℃水浴中热休克细菌45～60秒，迅速移入湿冰中，静置2分钟，加入900ul LB培养液，放入37℃恒温箱摇床，225rpm摇晃培养1小时。分别取50ul和100ul涂于两只含氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上，待干燥后，倒置，存放于37℃的培养箱中过夜。 次日，检查各培养皿中是否出现菌落。 实验结果 转化成功，培养皿中可见散在的菌落，其中加入100ul培养液的培养皿中的菌落数约为50ul培养液培养皿的1倍。 转化失败，培养皿上无菌落，或菌落布满如苔样，后者提示可能是抗生素浓度不够或失效。 1. 无菌落，失败。或培养条件不充分。 2. 菌落布满如苔样，失败，可能是抗生素浓度不够或失效。 3. 菌落布满，浓度太高，失败。 4. 出现菌落，符合要求。 注意事项 1．本实验采用的质粒含氨卞青霉素的抗性基因，因而采用含氨卞青霉素琼脂板作选择。常用的抗性基因还有四环素、金霉素等，要求明确以准备适宜的抗生素板。 2．整个实验须严格按照无菌操作要求进行，由于琼脂板含有抗生素，所以当实验环境干净者，可以直接放在普通实验台上操作。 3．接种环或自制玻璃涂棒在煤气灯上消毒后，须冷后方可涂皿。对于那些缺少实验室经验的研究人员，我们建议采用成L型的自制玻璃涂棒，这样由于L型的下端与琼脂板的接触面大，不易将琼脂板划破。 * * * * *