分子生物学常用技术在中医药研究中的应用实验课课程总结和部分技术介绍.ppt

* 加入MTT后，溶液呈浅黄色 加入DMSO后，溶液呈紫色 * 不同治法对大鼠肝癌IFRD1的作用 IFRD1在DEN诱导大鼠肝癌不同阶段的表达 高浓度IFRD1 RNAi后生长曲线 低浓度IFRD1 RNAi后生长曲线 IFRD1 （interferon-related developmental regulator 1，又称PC4、TIS7） * 实验37 Small RNA的提取与分析 实验38 报道基因与基因调控元件的检测 * 绪论曾提到过，GnRH基因是如何表达的？该基因的启动子中，哪些区域是重要的（增强子），如何确定？ GnRH基因 GnRH基因启动子 GnRH基因编码序列 启动子片段 报道基因 方法：把以上启动子切割成若干片段， 分别插入报道基因前面。该含启动子片段和报道基因表达载体转染工具细胞后，如果某一启动子片段对该基因高表达十分重要，则报道基因产物的读数会很高，如右图。如此可确定哪些启动子区域重要。 * 实验39 点突变PCR 点突变PCR的使用机会越来越多了起来。当研究发现中医药对某些特定基因的具有调整作用以后，自然要求深入了解实现对该基因调整的具体途径，比如中医药对某基因的调整是直接的，并通过这样的调整发挥疗效，抑或是间接的；如果这些基因的功能尚不清楚，那么，哪些部位是主要的功能区，改变了这些功能区会如何；在这些基因中中医药可能对启动子的哪些部位发生作用，等等，点突变PCR技术可以为回答这些疑问提供方便。 * 本方法是利用PCR技术，改变目的基因的个别或若干碱基，使该碱基所处位置的基因功能发生变化，以观察其意义。例如对于功能基因，可以检测点突变后功能是否发生变化，以逐步明确功能区的意义；或直接破坏一些已明确的功能区，使该基因失去原有功能；或用于筛选启动子中的重要序列、增强子的位置，了解一些已知转录调控蛋白及其特定结合序列的关系，等等。 点突变PCR技术的实现主要有两种方法，一种是比较老的办法，叫做两步法点突变PCR；另一种发展比较晚，并得益于Taq酶性能的提高，称之为一步法点突变PCR。如STRATAGENE公司QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit所采用的一步法点突变PCR。 * 原理 采用性能优良的DNA聚合酶PfuTurbo DNA polymerase，设计出含有突变位点的一对对应的引物，将含有目的基因的载体加热解链，退火时，突变引物会结合到载体插入片段的相应序列上，并以此作为引物，延伸。 该方法可以直接完成数千bp长度的含有插入片段的整个载体的复制，使复制的DNA含有突变位点。 * PCR后，PCR产物用Dpn I消化原先的模版，这是因为大多来自于大肠杆菌的DNA是甲基化的，对Dpn I敏感，而新延伸的DNA链则不然。消化后，所消化的质粒未突变链含有大量的切口，在转化大肠杆菌后，大肠杆菌会依据突变链将切口修补完善，并予以复制。从而完成基因的点突变。由于该技术仅使用一次PCR循环，所以被称为一步法点突变PCR。 * 实验40 基因敲除技术 实验41 Footprint * 实验42 凝胶阻滞分析 * 实验43 植物细胞的基因转化 * 第七章 分子生物学常用 网络资源及利用 第一节 美国国家生物技术信息中心（NCBI） 第二节 GenBank数据库查询与有哪些信誉好的足球投注网站 第三节 BLAST 第四节 EST的电子延伸 第五节 cDNA序列的蛋白阅读框架分析（ORF）、染色体定位，及其在机体各组织中的表达预测 第六节 PCR引物或序列寡核苷酸探针的在线设计 第七节 蛋白质分析 * NCBI的主页面 * * * * * * 小鼠外显子芯片，有关POMC基因，有4组探针，第4组基本不表达（作图取前3组探针）。其中，探针2落在ACTH内。4组探针杂交结果如下： AAACGGGAGGCGACGGAAGAGAAAAGAGGTTAAGAGCAGTGACTAAGAGAGGCCACTGAACATCTTTGTCCCCAGAGAGCTGCCTTTCCGCGACAGGGGTCCCTCCAATCTTGTTTGCCTCTGCAGAGACTAGGCCTGACACGTGGAAGATGCCGAGATTCTGCTACAGTCGCTCAGGGGCCCTGTTGCTGGCCCTCCTGCTTCAGACCTCCATAG