分子生物学常用技术在中医药研究中的应用实验课酶切重组质粒电泳从凝胶中回收dna.ppt

* * 实验 4 酶切重组质粒 电泳分离所插入的DNA 目 的 1．鉴定。鉴定所培养的单菌落中是否含有重组质粒，或仅含有自身环化的质粒。当酶切产物电泳后，重组成功者电泳后会出现大小不等的两条DNA条带，一条为线性质粒载体的DNA，分子量大，在后面，另一条为插入的目的基因，分子量小，在前面；而自身环化者仅有一条载体的DNA条带。 2．收获。通过电泳分离，使载体与插入目的基因分开，便于分别回收载体和已大量扩增了的插入目的基因。比如探针用片段。 本实验由2个部分组成： （1）酶切重组质粒； （2）DNA的琼脂糖凝胶电泳。 ● 关于限制性内切酶 本实验选用的限制性内切酶是分子生物学中最为常用的工具酶。通常不同的限制性内切酶分别能识别一小段双链DNA序列，长度多在4～6个核苷酸，且呈双重对称的DNA序列，并将其切断。有粘端和钝端两种形式： EcoR I ↓ 5...GAATTC...3 → 5...G AATTC...3 3...CTTAAG...5 3...CTTAA G...5 Pst I ↓ 5...CTGCAG...3 → 5...CTGCA G...3 3...GACGTC...5 3...G ACGTC...5 Sma I ↓ 5...CCCGGG...3 → 5...CCC GGG...3 3...GGGCCC...5 3...GGG CCC...5 利用这种特性，可以选择适当的酶来切割所需的DNA片段，或选择适当的酶切开载体，造成载体的粘端序列与插入DNA的粘端序列相同，以便于重组质粒。具体酶的特性、识别位点等可以参考不同公司的试剂目录。 ● 琼脂糖凝胶电泳 DNA的琼脂糖凝胶电泳是分子生物学实验中使用广泛的技术，该技术利用DNA分子在电场下向电场一极迁徙的特性。在pH中性的条件下，DNA分子由阴极向阳极迁徙。其间，DNA分子量大，摩擦阻力大，在凝胶的孔隙中迁徙得慢；分子量小，摩擦阻力小，迁徙快，在电泳一定时间后，大小不等得DNA分子可以得到有效得分离。同样分子量的DNA，环状的较线性的迁徙速度快。分离的DNA可以方便地用溴乙锭染色，方法是：（1）在灌胶时直接把溴乙锭混入凝胶，或（2）电泳后将凝胶浸入溴乙锭染液（我们推荐前者），染色后在紫外透射灯下可以看到橘红色的DNA条带，在一般实验室最低分辨能力（肉眼可见的）约为50～100ng。 原 理 采用限制性内切酶Hind III切开插入DNA与质粒载体，将这一反应液上样于琼脂糖凝胶，电泳，使分子量小的插入DNA前移，并与分子量大的在电泳中滞后的质粒载体DNA分开。 实验准备 （参考教材） 实验步骤 1．酶切质粒 取一洁净的1.5ml Eppendorf管，编好号，插入冰中，依次加入： 水 7ul 10×缓冲液 2ul BSA 2ul 重组质粒 8ul Hind III 1ul 20ul 盖上盖，混匀，将反应物甩入管底，置37℃水浴中温育1小时。 2．灌胶 将粘胶纸粘于灌胶模槽的两端，制成灌胶模。放入梳子。将模放于水平台上。 取一烧杯，放入： 琼脂糖 0.7 g 5×TBE 10 ml 水 40 ml 50 ml 混匀，加热，至琼脂糖彻底溶解。待稍冷后，加入5ul饱和的溴乙锭，轻晃混匀，然后轻轻倒入模子。用吸头吸去表面小泡。待冷却成胶。 如果梳子大且角锐利，应该离模具底部远些，以防拔梳子时将凝胶底部拔穿。 3．上样电泳 将胶两头粘胶纸揭去，移入电泳槽，梳子一侧靠近操作者，注入1×TBE缓冲液，浸没凝胶，轻轻拔出梳子。接上电源：阳极远离上样孔，阴极靠近上样孔（DNA向阳极移动）。加4ul上样缓冲液入酶切反应液，混匀，插入冰内。加2ul上样缓冲液入10ul小量制备的重组质粒，混匀，插入冰内。上样次序：由右向左。第1孔：5ul标准品梯度DNA，第2孔：12ul未经切割的重组质粒DNA，第3～6孔：24ul含上样缓冲液的酶切反应液。加样时，加样头尖端插入上样孔内1/3高度，轻轻将样品推入，使比重较大的样品自然沉入上样孔底。 避免刺入前后凝胶和刺穿凝胶底部（幻灯）。开启电源，电压调至100V。通常半小时后检查。