分子生物学常用技术在中医药研究中的应用实验课阳性单菌落扩增与小量dna制备.ppt

* * 实验 3 阳性单菌落扩增与 小量DNA制备 目 的 1．为进一步鉴定重组质粒，提供适量的质粒DNA——排除自身环化。鉴定方法主要有： （1）PCR法。采用载体两端的引物进行PCR，一旦插入成功，则可以在电泳的凝胶中见到与插入片段分子量大小一致的PCR产物。 （2）Southern blot法。将培养皿上的菌落转移到硝酸纤维素膜上，变性、固定，以插入片段为探针作Southern blot。重组成功者，在相应的菌落位置上可以见到放射自显影的黑点，培养皿上对应的菌落即为重组成功者。 （3）酶切鉴定法。 2．提供一定数量的DNA以满足一些实验 比如： （1）测序； （2）准备杂交用的探针。 这是该实验的两个主要目的。 原 理 挑选单一菌落，培养扩增。 离心收集扩增了的大肠杆菌，用碱性液裂解细菌，再经酸性溶液处理形成钾-SDS-蛋白质-膜复合物，离心后，此复合物与细菌染色体DNA、高分子量的RNA等得到沉淀，而细菌中小分子量的质粒DNA将溶于上清之中。 上清经乙醇沉淀后，得到质粒DNA。 实验准备 （参考教材） 实验步骤 1．第一天（通常为下午） 从琼脂平板上挑取单一菌落，接种到Falcon管内的5ml LB培养液（含氨卞青霉素或相应的抗生素）中。放入37℃恒温摇床中，225～250 rpm剧烈摇晃培养过夜（O/N），扩增大肠杆菌。 2．第二天（通常上午开始） （1）吸取1.5ml培养液，移入Eppendorf管中，台式离心机室温下1.4万转离心2分钟，弃上清，重复一至二次，以取得较大的沉淀。剩余培养液存入4℃冰箱。 （2）弃上清，加入100ul溶液I，盖 上盖，剧烈震荡（可以将管底抵于试管架 面上，划15下），充分浮悬细胞沉淀，置 -20℃冰箱内5分钟。 （3）自冰箱中取出试管，加入200ul 溶液II，轻轻颠倒混匀，放于冰上5分钟。 （4）加入150ul溶液III，轻轻颠倒混匀，放于冰上15分钟。 （5）放入台式离心机，室温下1.4万转离心3分钟，将上清移入一新的Eppendorf管，加入1ml 100％乙醇，混匀，放入-20℃冰箱5分钟。 （6）自冰箱中取出试管，迅速移入4℃环境下的台式离心机，1.4万转离心5分钟，小心弃去上清，倒置试管于纸巾上流尽乙醇。 （7）加入300ul TE和2ul RNase，重浮悬沉淀，放试管于37℃的水浴中温育30分钟。 （8）加入3M NaAC 34ul，混匀，加入1ml预冷的100％乙醇，-20℃存放5分钟。 （9）自冰箱中取出试管，迅速移入4℃环境下的台式离心机，1.4万转离心5分钟，弃去上清。 （10）加入1ml预冷的75％乙醇，迅速移入4℃环境下的台式离心机，1.4万转离心10分钟，弃去上清。 （11）旋转真空干燥10分钟。于冰上，溶解沉淀于20ul水中。 实验结果 通常可获得3～5ug DNA。 注意事项 1．在培养箱温度不够稳定等因素的影响下，有时隔夜后没有菌落形成，此时不必急于怀疑实验失败。建议再倒置培养一些时候，比如等到中午，或更晚一些时候，培养皿上会出现菌落。 2．挑取菌落必须是单菌落，而不是那些融合的菌落。如果培养皿上的菌落全部融合，则建议重新划板培养，直至有单菌落为止。不然一旦混有不同的菌落，可能会给以后的实验带来麻烦。 3．有关微型离心柱回收的利弊。原理与本实验近似，区别在于在DNA的回收阶段，不是采用醋酸钠-乙醇沉淀，而是采用微型柱。回收产物中往往留有痕量乙醇，这将妨碍一些对乙醇敏感的酶的活性，使后续工作困难。 4．离心要求平衡。方法是保证离心机转子对面两侧的试管孔内有含有相等数量的离心物和试管，使两侧平衡。如果仅有一个离心管，则要求对面放置另一根相同规格的离心管，管内加入与样品数量相等的水。具体方法可以参考生化有关书籍。 5．DNA的离心通常采用1.4万转的转速，10分钟的时间，这足以满足沉淀DNA的要求。 6．沉淀DNA或RNA离心时，应把Eppendorf管盖的连接蒂指向外侧，以保证离心后沉淀位于管底靠连接蒂的一侧，当DNA或RNA量少至难以辨认时，吸取上清之际，可避免吸头触及这一区域把所需沉淀吸起。 7．室温下，DNA沉淀容易浮起，所以整个操作过程应保持在4℃环境下进行，手指持试管上部，切勿接触试管底部。 8．吸取上清时动作要轻而快，加入75％