实验中医学中医细胞生物学实验研究.ppt

三、细胞的衰老与死亡 细胞衰老的特征：① 细胞内水分减少，导致细胞硬度增加，代谢速率减慢。② 色素颗粒沉积。③ 细胞器的衰老变化，包括细胞膜上的微绒毛数目增加，细胞膜的流动性降低，线粒体的数量减少而体积增大，细胞核核膜内折。④ 化学组成与生化反应的改变，如蛋白质合成的速度下降，细胞内酶的活性与含量发生变化。 按细胞死亡的特点，可大致分为两大类： 细胞凋亡：即程序性细胞死亡，是由基因控制的细胞自主有序的一种生理性细胞死亡，以细胞DNA早期降解为特征的、无明显细胞溶解的细胞自杀过程。 细胞坏死：即细胞病理性死亡。 细胞凋亡与细胞坏死的形态学区别 细胞凋亡的过程 正常胸腺细胞 凋亡胸腺细胞（注意凋亡小体） 细胞凋亡与细胞坏死的比较 肿胀 蛋白质合成下降 最初表现 弥漫性降解 DNA片段化 细胞核生化改变 溶酶体解体 溶酶体酶增多 胞质生化改变 毒素 内分泌 控制因素 肝细胞受毒素作用 胚胎神经元 典型细胞 毒素、缺血、酸碱度改变 胚胎、变态发育 始发因素 无 有 蛋白质合成 没有 数小时 潜伏期 缺少 常见 自吞噬 分解 致密 染色质 肿胀，Ca2+内吞 自身吞噬 线粒体 不能保持 能保持 膜的完整性 溶解 细胞皱缩、片断化，可见“凋亡小体” 形态学 细胞坏死 细胞凋亡 项目 第二节 细胞生物学常用实验技术 一、细胞培养技术 细胞培养技术是细胞体外培养的实验技术，分原代培养和传代培养。 培养的植物细胞团 原代培养：指来自于供体的组织或细胞在体外进行的首次培养，其培养细胞的主要特点是生物学特性与在体细胞最为接近。 大鼠超排卵卵巢组织形态与正常组织 卵泡颗粒细胞培养72小时 1 PMSG刺激后的大鼠双侧卵巢； 2 正常大鼠双侧卵巢。 ——引自董冰峰硕士毕业论文 常用的原代培养方法主要有组织块法和消化法： 组织块法：将刚离体的、有旺盛生长活力的组织剪成小块，接种于培养瓶中，新生的细胞大约在24h后可从贴壁的组织块四周游离出来，并继续生长。 消化法：指应用胰蛋白酶、胶原酶、DETA等生化的手段将已剪切成较小体积的组织块中妨碍细胞生长的基质、纤维等间质加以消化，使组织中结合紧密的细胞相互分离，从而形成含单细胞或细胞团的悬液，进一步培养后，便可生长出大量活细胞。 传代培养：指细胞在培养过程中，对细胞加以及时的分离、稀释，继续培养。 根据细胞在培养瓶中的生长方式，可分为：贴壁细胞和悬浮细胞。对于大多数贴壁细胞，主要采用0.25%胰蛋白酶液消化后稀释的方法进行传代。 垂体细胞前叶细胞培养24小时 垂体细胞前叶细胞培养72小时 1．细胞体外培养的一般条件 培养细胞一般接种于盛有pH 7.2～7.4的培养液的器皿中，放置在36～37℃、5%CO2加95%空气混合气体、95％～100%湿度的培养箱中。这种环境同样也适合多种细菌、支原体、真菌的生长。因此，通常在培养液中加入适量的抗生素（如青霉素、链霉素），并在细胞培养的全过程保持无菌操作。 CO2培养箱 细胞需要生长在具有充分营养物质的培养基中，培养基主要含有的成分有：① 含氮化合物；② 维生素和某些金属离子；③ 无机盐离子；④ 碳水化合物；⑤ 促生长因子。目前细胞培养的培养基已商品化生产。另外，大多数细胞的培养液中需加入血清，常用经56℃、30min灭活的胎牛血清、小牛血清，血清中含有多种细胞生长因子、促贴附因子以及其他生物活性物质。培养液中血清的含量一般为10%，以维持细胞的正常生长。 倒置显微镜 细胞计数板 生物安全柜及工作原理 培 养 板 培养瓶 培养皿 2．细胞的冻存与复苏 为了对以扩增细胞的保种，以及实验结束后细胞的长期存放，要求对体外培养的细胞及时冻存。冻存通常是指将细胞混悬在培养液中，加入适量的二甲亚砜（DMSO）或甘油后，冷冻储存在-196℃的液氮中。在细胞冻存过程中要注意采用缓慢冻存的方式，通常采用以下条件逐步冻存：首先将装细胞的冻存管置于4℃冰箱1h，再置于-20℃冰箱2h，然后置于-80℃冰箱2h，最后置于液氮长期保存。 复苏是指将-196℃液氮中冻存的细胞取出融解，使其活力恢复的过程。在细胞复苏过程中，要注意采用快速融化的方式，通常将装细胞的冻存管直接从液氮中取出放置于37℃水浴中，并不断摇晃，使冻