[医药卫生]基因组学、功能基因组学、蛋白质组学[精品].ppt

* * 序列图谱 以某一染色体DNA上所含的全部碱基序列绘制图谱，包括： 转录序列 非转录序列 是转录序列、非转录序列、调节序列及功能未知序列的总和。 * * DNA序列测定的意义 DNA的序列测定是分子生物学研究中的一项非常重要的和关键的内容。如在基因的分离、定位、基因结构与功能的研究、基因工程中载体的组建、基因表达与调控、基因片段的合成和探针的制备、基因与疾病的关系等等，都要求对DNA一级结构的详细了解。 * * DNA序列测定技术的发展 * * DNA测序的技术关键 DNA分离纯化技术的发展 DNA合成的随机终止或DNA的随机断裂 电泳技术的发展和完善 工具酶的发现 探针及探针标记 * * DNA序列测定的方法 Sanger的加减法 Sanger的双脱氧末端终止法 Gilbert－Maxam的化学修饰法 DNA序列的自动分析 基因芯片技术(杂交测序) PCR测序 * * DNA序列测定 加减法简介 1、加法测序：将测序DNA样品分类四分，形成四个反应体系。分别称为加A、加C、加G和加T。即在反应体系中加入dNTP时，加A体系中其它三种底物量相同，而dATP为过量。以被测DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下进行DNA的合成。因酶与模板的结合及合成过程为随机的而A为过量，因此合成反应终止在A。 * * ACGTTACGTTGCACGTTCCACTG TGCAATGCAACGTGCAAGGTGA TGCAATGCAACGTGCAA TGCAATGCAACGTGCA TGCAATGCAA TGCAATGCA TGCAA TGCA 加A体系 * * ACGTTACGTTGCACGTTCCACTG TGCAATGCAACGTGCAAGGTG TGCAATGCAACGTGCAAGG TGCAATGCAACGTGCAAG TGCAATGCAACGTG TGCAATGCAACG TGCAATG TG 加G体系 * * TGCAATGCAACGTGCAAGGTGAC ACGTTACGTTGCACGTTCCACTG TGCAATGCAACGTGC TGCAATGCAAC TGCAATGC TGC 加C体系 * * ACGTTACGTTGCACGTTCCACTG TGCAATGCAACGTGCAAGGT TGCAATGCAACGT TGCAAT 加T体系 加A I I I I I I I 加G I I I I I I I 加C I I I I I 加T I I I c ag t g g aa c g t g c a a c g t a a c g * * DNA序列测定 双脱氧合成终止法原理：是在加减法的基础上发展起来的新的测序方法，也是目前手工测序的主要方法。被测DNA分为四分，也称作加A、加C、加G和加T体系，以被测DNA为模板，由DNA聚合酶合成新的DNA分子。在四个反应体系中四种底物量相同，但额外增加ddNTP中的一种，反应时，酶选择底物是随机的，因此反应为随机终止。 * * * * OH * * * * DNA序列测定 模板：即被测DNA。有两种DNA可以做为测序模板： 纯单链DNA或变性DNA 双链DNA * * DNA序列测定 引物：与模板完全互补的15～29个核苷酸片段。 DNA聚合酶：测序反应中的常用DNA聚合酶有 大肠杆菌DNA聚合酶I大片段 测序酶：是一种经过化学修饰的T4噬菌体DNA聚合酶，完全失去了3’→5’外切活性。 TaqDNA聚合酶：用于PCR循环测序 * * * * DNA序列测定 Maxam－Gilbert化学降解法测序原理：利用特异的选择性试剂，专一性的随机断裂DNA成不同长短的片段。根据试剂的选择性及片段在高分辨力的聚丙烯酰胺凝胶电泳上的区带位置，判断DNA片段末端核苷酸的种类，从而测出DNA的序列。 * * DNA序列测定 选择性试剂 嘧啶选择性试剂：肼(H2NNH2)，在碱性条件下，能作用于T/C，使DNA在该处产生无嘧啶而使磷酸二酯键不稳定发生断裂。在有盐存在下，肼对T的选择下降，此时肼主要对C发生消除反应产生无嘧啶结构，使磷酸二酯键断裂。因此在肼的作用下，使DNA在T或C处断裂