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转Bt基因抗虫棉杀虫蛋白表达量的全生长期测定 李卓 许崇任 (北京大学生命科学学院环境生物学与生态学系, 北京 100871) 摘 要 我们用ELISA方法对三种转Bt基因抗虫棉，即33B、GK12、和转双价基因 (Bt 和CpTI) 的抗虫棉的杀虫蛋白的表达量进行了全生长期的测定，测定的器官包括叶片、花、蕾和棉铃，其中，花又分为苞叶、花蕊和花瓣。测定结果显示杀虫蛋白的表达含量具有一定的规律性，虫测结果与此基本一致。在整个生长期中，杀虫蛋白的表达含量在生长初期较低，在花期前后达到最大值，此后又渐渐降低。在各个器官中的表现均是如此。本文还对不同品种的转基因棉间的杀虫蛋白表达含量进行了比较。杀虫蛋白的表达含量的高低直接关系到杀虫效果，因此，本研究结果对于棉铃虫的综合防治和转Bt基因棉花的抗性管理具有重要的指导意义，同时也对转Bt基因棉花的安全性评价提供了一定的依据。 关键词：Bt 棉；Bt 杀虫蛋白；ELISA；生长期；表达含量 棉铃虫是我国棉花生产的重要致灾害虫，常年造成棉花产量损失在15%-20%之间。转Bt基因棉花是通过遗传工程手段把Bt基因导入棉花植株，从而得到对棉铃虫等鳞翅目害虫具有抗性的棉花。目前，已有多种具有抗虫性的Bt棉花品系问世。并在我国进行了大面积种植。从目前国内外种植的情况来看，Bt棉对防治棉铃虫的危害，提高棉花产量具有明显的作用，并且可以减少田间用药量，从而减少对环境的污染。但是Bt 杀虫蛋白在棉花体内的表达含量并不总是处于很高的水平，在棉花生长期的某些阶段，Bt 杀虫蛋白的表达含量较低，杀虫作用很弱或不具有杀虫作用，此时，就应进行化学杀虫，这样才能达到综合防治的目的。我们利用本实验室建立的ELISA方法，对几种不同品系的Bt棉的杀虫蛋白表达含量进行了全生长期的测定，并与虫测结果相对照，为建立新的棉铃虫的综合防治技术体系提供了科学依据。 材 料 与 方 法 实验材料 青紫蓝兔由北京大学实验动物中心提供。HD-1苏云金杆菌菌种由中科院动物所提供。棉组织由中国农业科学院植保所提供。 实验方法 1．2．1 抗原的制备 在Bt菌种复苏48h后接种，于30℃培养至芽孢晶体分离，用双相液体分离法提纯晶体蛋白，所得晶体蛋白的纯度在95%以上。冰冻干燥后保存。培养基为：鲜鲤鱼100g，食糖100g，琼脂30g，水1000mL，pH值7. 1．2．2 抗体的制备 用制备的晶体蛋白作为抗原，常规免疫年龄在6个月、体重在3kg左右的雌性健康青紫蓝兔。晶体蛋白溶于0.015mol/mL NaOH（室温过夜），以10mmol/mL磷酸钠缓冲液(pH7.0)透析过夜。每次免疫每只兔子抗原量为1mg，共3次，第1次加弗氏完全佐剂四足注射，第2次加不完全佐剂背多点注射，第3次不加佐剂耳缘静脉注射，每次免疫之间间隔30天。半年后颈动脉取血，4℃冰箱静置让血清充分析出。双相免疫扩散法测得效价为1:64。血清加万分之二的叠氮钠在-20℃保存。 取样 取样时间从6月19日到9月7日，其中，叶片从嫩叶取到老叶，共5次，蕾取了3次，由于数量上及生长条件的限制，花取了两次，铃取了一次。中国农科院植保所负责对每次取的样品进行虫测。 用ELISA方法进行检测 1． 每个样品称0.4克，加1.0 ml CBS缓冲液研磨成浆状。 2． 8000 rpm离心5 min，取上清液，加可溶性PVP（聚乙烯吡咯烷酮）。1ml液加25 mg PVP.（可以将PVP先溶于CBS中，使浓度为50mg/ml，每ml样品上清液加0.5ml）放置0.5小时。 3． 8000rpm离心5min，取上清50μl，加入酶标板的孔中，加CBS液150μl补足至200μl。在同一块酶标板上用2行（2个重复）各8个孔检测Bt蛋白梯度用来作标准曲线。标准蛋白：每孔10μl Bt晶体蛋白液+190μl CBS（Bt蛋白梯度为每孔0ng、1ng、3ng、5ng、7ng、10ng 、20ng 、40ng，），37℃保温2.5hr（或4℃冰箱过夜）。 4. 完成步骤3之后，立即用CK棉籽粉液吸附一抗，一抗同棉籽粉液的体积比是1:10，混匀，放4℃冰箱 2.5小时以上备用。 5. 将酶标板孔内液体（包被液）甩去，并在滤纸上轻磕酶标板，使孔中没有残液。然后每孔加300ul PBST放置3min.洗涤，3min后将液体甩去，再在滤纸上轻磕酶标板，重复三次。 6. 用PBST稀释吸附好的一抗，使所给原液稀释1000倍。每孔加一抗稀释液150μl，37℃保温0.5hr。 7. 用PBST洗涤三次，操作同步骤5，再将二抗（羊抗兔）原液用PBST稀释500倍。每孔加二抗稀释液150μl，37℃保温0.5hr。