RNA提取过程.doc

RNA提取步骤及注意事项 实验步骤如下： 　　1.取50—100mg的组织,加入1ml Trizol试剂，用匀浆器打匀(Trizol先放于冰上)。 　　2.将匀浆室温放置5min。 　　3.加入00μl氯仿,剧烈震荡混匀30s，冰上静置min。 　　4.12000rpm，4离心15min。 　　5.将上清液小心转移到新的1.5ml离心管中（取400μl），加入等量体积的异丙醇，上下颠倒几次混匀，室温下放置15min。（此步中注意：不要吸取任何中间层物质，宁缺勿烂。） 　　6.12000rpm，4离心15min。 　　7.小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失。 　　8.用70%乙醇（DEPC处理的水配制）洗涤1次，加入700μl乙醇，将RNA沉淀弹起，漂洗。（此时RNA是不溶解的） 　　9.000rpm，室温离心10min。 　　10.尽可能彻底地吸走上清，防止RNA沉淀丢失。 　　11.真空离心干燥3—5分钟，或放在室温下使乙醇完全挥发掉。 　　12.沉淀用0μl DEPC-H2O溶解。如发现沉淀难溶，68处理10min。 　　13.RNA检测 　　(1)测定样品在260nm和280nm的吸光值按1OD=40μg/ml RNA计算RNA的产量。 　　OD260/OD280在1.8-2.0。 　　(2)进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,确定RNA的完整性和污染情况。 注意事项： ??? 1.获得RNA效率低有一下原因 ????? a:样品裂解或匀浆处理不彻底 ????? b:最后得到地RNA沉淀未完全溶解 ??? 2.A260/A280 ????? a:检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而是溶于水。低离子浓度和低PH条件下，A280值会较高 ????? b:样品匀浆时加地试剂量太少 ????? c:匀浆后样品未在室温放置2分钟 ????? d:水相中混有有机相 ????? e:最后得到地RNA沉淀未完全溶解 ??? 3.RNA降解原因 ????? a:组织取出后没有马上处理或冷冻 ????? b:样品或提取地RNA沉淀保存于-5--20度，未在-60--70度保存 ????? c:细胞在胰酶处理时被破坏 ????? d:溶液或离心管未经RBase去处理 反转录成cDNA第一链在20ul体系中，加入ul总RNA, 1 ul oligo dT 70°c温育10分钟后立即冰浴冷却，继续加入4ul 5 x Buffer, 2ul ul IOMm dNTPs ( IOMm/种)，混匀后于42保温2分钟，加入1ul( 200U)的反转录酶，42继续温育0分钟。70C 10分钟灭活反转录酶。