发酵8第八章基因工程菌培养.ppt

3、诱导时间对外源蛋白表达的影响 诱导时间：加入诱导剂后的培养时间 随着诱导时间的延长，外源蛋白的表达量增加，但外源蛋白在细胞内的积累，对重组菌产生毒性，合成速率下降，甚至产物被分解。 诱导时间对酶表达水平和活力的影响 诱导时间 酶活力 酶表达水平 0 0.02 1 52.3 37% 2 118.8 57% 3 120.8 67% 4 165.0 68% 5 139.9 64% *L-天冬酰氨酶 4、诱导时机对表达的影响 诱导时机指加入诱导剂的时间 以天冬酰氨酶表达为例，见表。在A600=0.295*10时生长速度比较快，这时菌体进入诱导状态，酶蛋白的积累加快，酶活和表达水平都较高。而菌体进入对数期后期，由于发酵液中营养的消耗，及代谢产物的积累，使菌体的生长速度受到抑制。在此状态下诱导，表达显然受到影响。 诱导时机对酶表达水平和活力的影响 生物量（A600） 酶活力 酶表达水平 0.015 6.0 15.0% 0.049 19.1 31.1% 0.160 72.5 41.5% 0.225 102.6 49.8% 0.295 165.0 57.7% 0.360 105.5 53.4% 0.410 62.4 44.5% 0.450 30.2 22.5% *L-天冬酰氨酶 0.0340.1110.0650.07 0.0650.05 0.04 5、乙酸对生长和表达的影响 （1）乙酸的产生及抑制作用机理 当葡萄糖加入量超过菌体生长和二氧化碳产生所需要量或在缺氧的条件下便会产生大量的乙酸，特别是在培养时间较长的高密度发酵过程中，问题更为严重。 为什么会产生乙酸？ Han认为细菌在低比生长速率下通过氧化代谢（三羧酸循环）的作用产生的能量足以满足合成和异化的需求，不会产生乙酸，而在髙比生长速率时，大肠杆菌仅靠氧化代谢不能提供足够的能量，必须通过乙酸生成途径提供ATP和NADH。 乙酸的生成需要两个关键性的酶，磷酸转乙酰酶（Pta）和乙酰激酶（Ack），它们催化葡萄糖代谢中从乙酰辅酶A生成乙酸的两步酶促反应。 EL-Mansi和Luli假设的乙酸抑制机理是：乙酸在中性pH环境中以离子化（CH3COO－）和质子化（CH3COOH）两种形式存在，质子化的乙酸具有弱的亲脂性可以穿过细胞质膜进入胞内，在细胞内（pH7.5）解离成CH3COO-和H＋，这样就降低了膜内的pH值，使膜内外的pH差减小，减弱了质子的推动力，产生的能量就被大大减少，扰乱了细胞的正常代谢和生理活性。 （2）减少乙酸积累的对策 宿主菌 不同的宿主产生乙酸不同，可通过诱变使乙酸生成途径中的两个关键酶，有一个突变了或活性降低了，使乙酸合成受阻。 培养基 培养基组成能影响乙酸的产生，特别是碳源的含量影响最大。在基本培养基中大肠杆菌产生的乙酸比在复合培养基中产生少。另外用甘油取代葡萄糖可以降低乙酸的生成，Han等在培养基中加入某些氨基酸（甘氨酸、甲硫氨酸）减轻了乙酸的抑制作用，提高了重组菌的生长速率和重组蛋白的产率。 Klemam等研究了培养基pH值对产生乙酸的影响，发现重组大肠杆菌W3200在葡萄糖浓度为5g/L、pH6.0的培养基中乙酸生成量为6g/L.而pH7.5为12g/L。 降低比生长速率 细菌比生长速率高，乙酸的比生成速率就高，一般来说，在合成培养基中，当重组菌的生长速率超过某个临界值便产生乙酸。在连续培养中，当稀释速率超过0.2h－1才能检测到乙酸的存在。较低的比生长速率虽然产酸少，但同时对产物表达不利，因此选取合适的比生长速率才能达到高密度、高表达发酵。 降低培养温度 将温度从370C降低到26-300C可以降低菌体对营养物的吸收率，从而减少有机酸的形成。 透析