荧光细胞化学样品制备和检测相关技术.ppt

荧光细胞化学样品制备和检测技术;什么是显微镜荧光检测？;落射荧光与透射光观察的区别;落射荧光与透射光观察的区别;什么是荧光 ?;荧光的性质;荧光显微镜的优点和用途;标本制作的顺序;单纯固定液;单纯固定剂;混合固定液;混合固定液;混合固定液;取材;组织脱水;包埋;切片;切片;切片;封片;组织和细胞的自发性荧光检测;荧光组织细胞染色（荧光探针检测，荧光标记检测）;荧光染色方法;细胞骨架F-actin（F-肌动蛋白）染色：;Fluorochromes and Stains;DiI: lipophilic membrane marker Rhodamine 6G, MitoTracker red: mitochondrial and ER marker Propidium iodide, Ethidium Bromide, SYTO 25: impermeant and permeant nucleic acid stain;TO-PRO-3;细胞荧光离子探针;Physiology Probes;SNARF: pH indicator emission ratio FM1-43, RH-414: plasma membrane Fura red: calcium indicator, decreased fluorescence on binding DIC18(3), DIC16(3): ER marker LysoTracker Yellow DND-68: lysosomal marker MitoTracker Orange, Rhodamine B Hexyl ester, Tetramethylrosamine: mitochondrial marker;Mouse; hippocampal neurons; fluorescence of GFP Shigeo Okabe Department of Anatomy and Cell Biology Tokyo Medical and Dental University;免疫荧光细胞化学技术;免疫荧光细胞化学分直接法、夹心法、间接法和补体法四种。;2、间接法： 1）检查抗体法（夹心法） 先用特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞抗体与荧光抗体之间。 2）检查抗体法 用已知抗原细胞或组织标本的切片，加上待测血清，如果其中含有切片中某种抗原的抗体，抗体便沉淀结合在抗原上，再用间接荧光抗体（抗种属特异性IgG荧光抗体）与结合在抗原上的抗体反应（如检测人血清中的抗体必需用抗人IgG荧光抗体等），在荧光显微镜下可见抗原抗体反应部位呈现特异性荧光。此法是检验血清中自身抗体和多种病原体抗体的重要手段。;3）检查抗原法双薄片 先用特异性（对细胞或组织内抗原）抗体（或称第一抗体）与细胞标本反应，随后用缓冲盐水洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体（第二抗体，有种特异性）与结合在抗原上的抗体（是第二抗体的抗原）结合，形成抗原-抗体-荧光抗体的复合物。 由于结合在抗原抗体复合物上的荧光抗体显著多于直接法，从而提高了敏感性。如细胞抗原上每个分子结合3~5个分子抗体，当此抗体作为抗原时又可结合3~5个分子的荧光抗体，所以与直接法相比荧光亮度可增强3~4倍。 灵敏度高，只需制备一种种属间接荧光抗体，可以适用于多种第一抗体的标记显示。是目前使用得最广泛的技术。缺点为容易出现非特异性染色反应。;3、补体法 1）直接检查组织内免疫复合物法 用抗补体C3等荧光抗体直接作用组织切片，与其中结合在抗原抗体复合物上的补体反应，而形成抗原抗体补体复合物 — 抗补体荧光抗体复合物，在荧光显微镜下呈现阳性荧光的部位就是免疫复合物存在处，此法常用于肾穿刺组织活检等。 2）间接检查组织内抗原法 常将新鲜补体与第一抗体混合同时加在抗原标本切片上，经37℃孵育后，如发生抗原补体抗体反应，补体就结合在此复合物上，再用抗补体荧光抗体与结合的补体反应，形成抗原抗体—抗补体荧光抗体的复合物。 此法优点是只需一种荧光抗体可适用于各种不同种属来源的第一抗体的标记显示。缺点为容易出现非特异性染色反应。 ;4、双（多）重免疫荧光标记法 在同一细胞组织标本上需同时检查两种或两种以上抗原时，要进行双（多）重荧光染色。 一般均采用直接法。将这些荧光抗体（如抗A和抗B）以适当比例混合，加在标本上（也可分别加），孵育后，按直接法洗去未结合的荧光抗体。不同荧光标记抗体最好用波长范围分得比较开的荧光素。如绿色与红色搭配。;Date;研究中常用荧光染料和探针;研究中常用荧光染料和探针;研究中常用荧光染料和探针;研究中常用荧光染料和探针;研究中常用荧光染料和探针;研究中常用荧光染料和探