如何进行稳转株筛选稳定转染过程.PDF

活性蛋白整体方案 Active Protein Solutions 如何进行稳转株筛选 本文主要介绍了稳定转染的原理 ，常用方法以及如何进行稳转株筛选得到高表达的细胞株 ，同时包括稳定转染的应 用及其影响因素 ，从而满足活性蛋白的大量制备。 利用哺乳动物系统生产蛋白的方式有两种 ：瞬时转染和稳转株筛选。通过稳定细胞系构建筛选稳定表达细胞株。针 对瞬时转染 ，外源基因在短时间转录翻译得到的蛋白量较少 ，能够满足小量蛋白制备 ，大量生产成本很高。相对于 此 ，稳定转染的是将外源基因整合到细胞自身的基因组上 ，随着细胞的生长分裂外源基因可以稳定转染表达 ，同时 经过抗生素加压筛选 ，最终得到能够稳定转染表达蛋白的细胞株 ，稳转株生产蛋白稳定性更好 ，批次差异性更小。 稳定转染过程 细胞复苏 细胞复苏是将保存在液氮冰箱中的细胞株解冻并重新培养 的过程。细胞复苏的关键是快融 ，防止在解冻过程中 ，产 生的水珠形成冰晶损伤细胞。细胞复苏一般步骤如下 ：  预先加热水浴锅 ，温度至 37-40℃ ，并在离心管中 准备好 10ml培养基 ；  从液氮罐中取出细胞 ，迅速放进预热的水浴锅中 ， 镊子夹住冻存管晃动 ，使其受热均匀 ；  当冻存管内达到 90%左右融化时 ，注意用酒精擦 拭冻存管消毒 ，将细胞悬液吸入含有 10ml培养基 的离心管中 ；  离心 5min ，去除上清 ，得到沉淀 ；  用培养基悬浮沉淀 ，并接种到培养瓶常规培养。  细胞复苏后 ，生长一段时间 ，细胞状态良好 ，细胞活力达到 95%以上 ，说明细胞复苏成功。  瞬时转染以脂质体转染为例的操作流程。 Tel: 025 5889-4959 www.DetaiB Order@DetaiB （ ） 活性蛋白整体方案 Active Protein Solutions  将复苏后常规培养的细胞按照 1-3x10^5接种到 6孔板中 ，加入 2-4ml 的完全培养基 ，混匀放置在二氧化 碳培养箱中 37℃过夜 ；  无菌状态下配置如下溶液 ：a 用 100ul 的无血清培养基稀释 4ug 的待转染的质粒; b 用 100ul 的无血清培 养基稀释 10ul的 Lipofectamine转染试剂 （血清的存在会影响转染效率 ，因此要使用无血清培养基转染 ）  将 ab溶液混合并摇匀 ，室温下放置 15-20min左右 ；  细胞培养至 80%单层左右 ，用无血清培养基洗涤细胞 2次 ，每孔加入 1.8ml 的无血清培养基 ，并将混合后 的 ab溶液逐滴加入到每孔 ，按十字方向轻摇混匀 ，二氧化碳培养箱中 37℃培养 24 小时 ；  将转染液倒出 ，换为完全培养基继续培养。 稳转株筛选 48h加入选择性抗生素进行稳转株筛选 ，预实验确定抗生素的杀伤浓度 （在规定时间内 ，将细胞全部杀死的最低浓 度 ）。  提前一天接种细胞与 24 孔板中 ，待第二天长成 25%单层为宜 ，二氧化碳培养箱中 37℃过夜培养 ；  第二天将培养液换成含抗生素的培养基 ，抗生素浓度按梯度递增 ；  培养 7-10天左右绝大多数细胞死亡抗生素浓度为准 ，筛选细胞时刻适当提高浓度 ；  二氧化碳培养箱中 37℃培养 72h后按照 1 10 的比例将转染细胞传代 ，使用预实验得到的抗生素浓度的培 养基培养。后挑选单克隆 ，有限稀释法挑取单克隆。  Western blot 或 ELISA 检测蛋白的表达情况 ，挑取多个单克隆进行表达检测 ，筛选出表达量最高的克隆传 代并保存。最终进行稳转株筛选高表达的稳定细胞株 ，相对于瞬时转染稳定细胞系构建需大量的时间和成 本 ，是满足活性蛋白大量制备的最好方