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如何进行稳转株筛选稳定转染过程
活性蛋白整体方案
Active Protein Solutions
如何进行稳转株筛选
本文主要介绍了稳定转染的原理 ,常用方法以及如何进行稳转株筛选得到高表达的细胞株 ,同时包括稳定转染的应
用及其影响因素 ,从而满足活性蛋白的大量制备。
利用哺乳动物系统生产蛋白的方式有两种 :瞬时转染和稳转株筛选。通过稳定细胞系构建筛选稳定表达细胞株。针
对瞬时转染 ,外源基因在短时间转录翻译得到的蛋白量较少 ,能够满足小量蛋白制备 ,大量生产成本很高。相对于
此 ,稳定转染的是将外源基因整合到细胞自身的基因组上 ,随着细胞的生长分裂外源基因可以稳定转染表达 ,同时
经过抗生素加压筛选 ,最终得到能够稳定转染表达蛋白的细胞株 ,稳转株生产蛋白稳定性更好 ,批次差异性更小。
稳定转染过程
细胞复苏
细胞复苏是将保存在液氮冰箱中的细胞株解冻并重新培养
的过程。细胞复苏的关键是快融 ,防止在解冻过程中 ,产
生的水珠形成冰晶损伤细胞。细胞复苏一般步骤如下 :
预先加热水浴锅 ,温度至 37-40℃ ,并在离心管中
准备好 10ml培养基 ;
从液氮罐中取出细胞 ,迅速放进预热的水浴锅中 ,
镊子夹住冻存管晃动 ,使其受热均匀 ;
当冻存管内达到 90%左右融化时 ,注意用酒精擦
拭冻存管消毒 ,将细胞悬液吸入含有 10ml培养基
的离心管中 ;
离心 5min ,去除上清 ,得到沉淀 ;
用培养基悬浮沉淀 ,并接种到培养瓶常规培养。
细胞复苏后 ,生长一段时间 ,细胞状态良好 ,细胞活力达到 95%以上 ,说明细胞复苏成功。
瞬时转染以脂质体转染为例的操作流程。
Tel: 025 5889-4959 www.DetaiB Order@DetaiB
( )
活性蛋白整体方案
Active Protein Solutions
将复苏后常规培养的细胞按照 1-3x10^5接种到 6孔板中 ,加入 2-4ml 的完全培养基 ,混匀放置在二氧化
碳培养箱中 37℃过夜 ;
无菌状态下配置如下溶液 :a 用 100ul 的无血清培养基稀释 4ug 的待转染的质粒; b 用 100ul 的无血清培
养基稀释 10ul的 Lipofectamine转染试剂 (血清的存在会影响转染效率 ,因此要使用无血清培养基转染 )
将 ab溶液混合并摇匀 ,室温下放置 15-20min左右 ;
细胞培养至 80%单层左右 ,用无血清培养基洗涤细胞 2次 ,每孔加入 1.8ml 的无血清培养基 ,并将混合后
的 ab溶液逐滴加入到每孔 ,按十字方向轻摇混匀 ,二氧化碳培养箱中 37℃培养 24 小时 ;
将转染液倒出 ,换为完全培养基继续培养。
稳转株筛选
48h加入选择性抗生素进行稳转株筛选 ,预实验确定抗生素的杀伤浓度 (在规定时间内 ,将细胞全部杀死的最低浓
度 )。
提前一天接种细胞与 24 孔板中 ,待第二天长成 25%单层为宜 ,二氧化碳培养箱中 37℃过夜培养 ;
第二天将培养液换成含抗生素的培养基 ,抗生素浓度按梯度递增 ;
培养 7-10天左右绝大多数细胞死亡抗生素浓度为准 ,筛选细胞时刻适当提高浓度 ;
二氧化碳培养箱中 37℃培养 72h后按照 1 10 的比例将转染细胞传代 ,使用预实验得到的抗生素浓度的培
养基培养。后挑选单克隆 ,有限稀释法挑取单克隆。
Western blot 或 ELISA 检测蛋白的表达情况 ,挑取多个单克隆进行表达检测 ,筛选出表达量最高的克隆传
代并保存。最终进行稳转株筛选高表达的稳定细胞株 ,相对于瞬时转染稳定细胞系构建需大量的时间和成
本 ,是满足活性蛋白大量制备的最好方
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