油田区域土壤苯甲基琥珀酸合成酶bssA基因丰度及其.doc

江汉油田区典型农田土壤 左小虎 王明霞 姚炎红 李振轮 周志峰? （西南大学资源环境学院，重庆 400716） 摘 要 油田区土壤易受烃类物质影响并可能富集了特异的石油烃降解微生物类群。本研究（etroleum hydrocarbons, PHs）代谢的基因-）分子标识，通过克隆文库结合末端限制性片段长度多样性ion Fragment length polymorphism，T-RFLP）方法，研究油田区土壤群落结构并探讨其。 ?mg kg-1之间，石油烃污染程度较低。T-RFLP的分析表明不同土壤样品中明显Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，多环芳烃）优势bssA还原菌或较近的亲缘关系分析进一步表明土壤氮、磷s含量均是影响的重要因子β-变形菌和δ-变形菌，并与地杆菌属（Geobacter）、索氏菌属（Thauera）和固氮菌属（Azoarcus）具有较近的系统发育亲缘关系。这些微生物可能通过硝酸盐、硫酸盐及铁还原。；bssA） S154.1 A 石油烃（Petroleum hydrocarbons, PHs）Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs）和苯系物（苯、甲苯、乙苯、二甲苯等）关注会直接或间接危害人类健康。AHs和苯系物降解微生物一直是学术界关注的热点[6-7]。一般认为，在纯培养体系有氧条件下PAHs及苯系物降解的在苯系物、类及萘等低分子量s的厌氧降解过程中，由延胡索酸发现于β-过程，中关键环节是enzylsuccinate synthase, BSS）基因所编码的延胡索酸加入到]，形成的（R）-苯甲基琥珀酸酯[11-13]可经随后的为oA[9]。随后的及s的厌氧降解过程中。如，, SRB）和硝酸盐还原菌（Nitrate-reducing bacteria, NRB）在厌氧条件下也可以对n-烷烃进行类似于甲苯添加延胡索酸）而萘基-2-甲基-琥珀酸合成酶）完成厌氧，编码关键基因（）分子标识物环境中苯系物等类化合物厌氧代谢微生物表征受污染程度及降解能力。，Frederick及海洋）16S rRNA基因分类迥然不同的δ-变形菌和梭菌类群。Alejandro 等[21]比较了bssA、nmsA和assA基因的遗传多样性，研究了原油泄漏区域海水及基因的丰度多样性，与污染程度，bssA为代表的延胡索酸加入的关键基因具备较强的专一性未来石油污染微生物标识物。7, 22]，研究其中的关键功能基因多样性对污染环境生物修复具有重要意义。 油田区域的土壤有受原油风险具有油气开发历史的江汉油田，约20标识克隆文库T-RFLP的方法油田环境因子的关系研究类有机物土壤厌氧代谢的微生物机理。 1 1.1 土壤样品采集的油气开发历史，是最早开发的油田之一为30～40 半径内～?cm表层新鲜土壤（潮土，粘每个采样点 m2的范围内，随机选择点，进行多点混合初步剔除石块和杂物，单个土样的采集样点均上述方法采集重复的土壤样品具体采样点的地理信息如下表。好的于自封袋，置于放有冰袋的箱子中回实验室。随后，过?mm筛分装，放于?℃用于基本性质测定，部分置于-20?用于提取土壤性质及PAHs含量测定 PHS-3C型pH仪测定。土壤总有机质、有效磷、铵态氮和硝态氮的测定参照《》[–H2SO4法）、钼锑抗比色法、靛酚蓝分光光度法和萘乙二胺分光光度法测定?g经冷冻干燥的土壤样品、10?g无水硫酸钠及少量铜粉置于同一烧杯中混匀，无损移入滤纸桶，加入150?ml丙酮–正己烷（1:1）混合液浸泡土壤样品12?h，将滤纸桶装入索氏提取器中75?℃提取6?h；提取液于-46?Kpa，45?℃下～?ml，然后用硅胶层析柱（1?cm无水硫酸钠，6?cm活化硅胶和3?cm氧化铝）净化；以15 ml色谱级正己烷预洗，70 ml二氯甲烷正己烷混合液3:7，V/V）洗脱～?ml，再加入25?ml甲醇进行溶剂置换，再旋转蒸发浓缩并用甲醇定容至1?ml；最后用高效液相色谱仪（HITACHI L-7100，日本）测定各样品中PAHs含量。 1.3 土壤DNA提取? DNA Isolation Kit（MO BIO，美国）试剂盒提取土壤DNA。称取0.5?g土壤样品，具体操作步骤用1%的琼脂糖凝胶电泳检测提测定浓度?℃保存备用。 1.4 克隆文库构建及T-RFLP分析 表1 PCR扩增引物及反应程序 目标基因 Target gene 引物 Primer 引物序列 Sequence, 5–3 反应程序 Reaction procedure 参考文献 Reference bssA 7772f GACATGACCGACGCSATYCT 94?℃3?min；94?℃30?s，58?℃30?s，72?℃1