第五章_分子生物学研究方法(朱玉贤版)推荐.ppt

将重组DNA导入宿主细胞 基因工程菌 HB101, JM109 转化(transformation) 制备感受态细胞 冷的氯化钙处理，细胞处于最适摄取和容忍外来DNA的生理状态 感染(infaction) 转导(transduction) ：由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程 转染(transfection)：真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。 * 目的基因的筛选和鉴定方法(screening/selection) ①免疫学方法 ②分子杂交 探针 ③原位杂交 ④ PCR ⑤限制性酶切图谱 ⑥ 遗传学方法 插入灭活法(insertion inactivation):抗药性标志选择 （蓝白斑筛选） * 转化子筛选指示系统—蓝白斑筛选 在培养基中加入诱导物IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）和底物x-gal，IPTG诱导LacZ表达产生?-半乳糖苷酶， ?-半乳糖苷酶使x-gal水解，产生兰色化合物，形成兰色菌落； 当插入外源片段，使LacZ基因失活，形成无色菌斑。 * IPTG:异丙基巯基半乳糖苷 X-gal(5- 溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷) 利用α互补原理筛选重组体DNA分子 * 利用菌落颜色筛选重组子 * bp —1534 — 994 — 695 — 515 — 377 — 237 A B C M 重组DNA的酶切鉴定图谱(A:原载体;B:酶切产物;C:重组DNA;M:分子量标准 * 通过灭活质粒所携带的抗生素抗性基因来筛选重组DNA分子 * 检测重组克隆的菌落杂交技术 * 重组DNA技术的基本过程小结 目的基因的制备 载体的选择和制备 DNA分子的体外连接 将外源DNA导入宿主细胞 目的基因的筛选和鉴定 * 基因工程的基本操作步骤及其应用意义 基因工程的基本操作步骤： ①获取外源目的基因； ②寻找基因载体(通常为质粒、噬菌体等)使用限制性内切酶，使目的基因与载体产生相同粘性末端，两个末端互补连接，形成重组DNA； ③通过转化(或感染)将重组DNA引入寄主细胞； ④从大量的寄主细胞中筛选出带有重组DNA的细胞进行培养。 * 意义： ①利用基因工程技术，可以大量生产在一些正常细胞中产量很低的多肽物质，用于医药等工业生产中； ②定向改造生物基因结构，生产抗病强、品质优的各种农副产品，以提高经济价值； ③用于生命科学的基础研究； ④值得注意的是，基因工程技术若使用不当、管理不善，也会给人类带来灾难。 * 作业: 1、用Sanger双脱氧链终止法进行DNA自动序列分析(即DNA测序分析)的原理。 2、PCR技术原理。 3 、转化子的蓝白筛选原理。 * * （4）质粒ＤＮＡ电泳 Ｌ OC SC * 5.常用的克隆载体Ⅱ——噬菌体载体 * （1）λ噬菌体(λphage)的特点： ①.一种能感染大肠杆菌的病毒，野生型含有双链线状DNA分子（λDNA ） ，长度48.5kb, 分子两端各有一个12bp组成的粘性末端, 感染大肠杆菌后,线状DNA通过粘性末端互补连接成环, 连接处称COS位点。 ②. 本身有复制体系; ③. 感染大肠杆菌后要进行环化 * λDNA感染大肠杆菌后的环化过程 * ④. λDNA在体外可包装成病毒颗粒, 感染效率高; ⑤. 载体容量大,可装入大片段外源DNA (20kb); ⑥. 可人工加入多克隆位点; ⑦. 筛选容易——噬菌斑筛选; ⑧. 主要用于DNA文库的构建. * （2）M13噬菌体 特点：一种丝状单链噬菌体，闭环正链ssDNA，全长6.5kb, 感染大肠杆菌后, ssDNA 转变为dsDNA, 可用作克隆载体。 最大优点：产生单链DNA, 可制备单链DNA探针。 *  柯斯质粒(cosmid) 粘性质粒基本结构特征:是一种人工改造的载体,双链环状DNA组成:λDNA的 cos区+质粒+控制包装作用的序列克隆容量：31 ~ 45kb  常用的克隆载体Ⅲ——柯斯质粒 * 4. cosmid较小, 约4 – 6kb.5. cosmid重组体可象噬菌体一样进行外壳装配, 形成噬菌体颗粒, 感染大肠杆菌效率比质粒高得多, 进入宿主细胞后, 只能象质粒一样扩增, 并依赖抗药性被筛选. 1. 具有λ-DNA的COS位点;2. 具有质粒的复制起点和抗药性标记 (Ampr);3. 具有多种单一的酶切位点. 柯斯质粒(cosm