第六章 植物细胞制药推荐.ppt

11、转基因植物生产抗体 植物抗体(plantibody)是利用基因工程技术在植物中表达或生产抗体, 即将编码全抗体或抗体片段的基因导入植物,在植物中表达出具有功能性识别抗原及结合特性的全抗体或部分抗体片段, 是抗体基因工程研究的一个新领域。 植物抗体的优点： (1)高表达。在植物中表达抗体, 重组抗体的产率可达植物总蛋白的4% , 这是一般真核表达系统所不能达到的; (2)低成本。在植物中表达重组抗体, 可用大规模大田种植, 条件相对简单, 价格低廉; (3)外源抗体基因片段可以整合进染色体中稳定遗传, 同时对植物的生长没有影响; (4)转基因植物株可以很简单地通过种子的形式长期保存; (5)植物细胞可对表达的重组抗体蛋白进行正确的组装和后期加工, 同时植物表达系统表达的抗体是以二聚体形式存在, 因此表达产物的亲和力高, 有助于全面发挥抗体的功能. * （1）利用转基因植物表达的抗体 1989年美国Hiatt等从小鼠中克隆了抗体重链和轻链基因, 并分别用农杆菌介导法转入烟草, 在后代同一植株中表达出由重链和轻链组装的功能性抗体, 抗体量可达烟草叶总蛋白的1. 3%。 分泌性抗体,完整抗体,嵌合抗体,Fab片段,scFv片段和双特异活性scFv片段等先后成功地在烟草、马铃薯、水稻、小麦或拟南芥的叶片、根、块茎和种子等器官中表达, 表达水平通常占TSP的0. 5% ～2% 。 1990年, During等将抗体重链和轻链基因装入同一个表达载体盒, 转入烟草后获得有抗原结合活性的抗体。 1991年,将一种神经肽单抗的VH 基因插入植物表达载体 在烟草中表达, 这种单域抗体具有抗原结合特性, 表达量占可溶蛋白的1%。 * 1992年, Owen等构建成抗光敏色素的scFv基因, 导入烟草后, scFv基因在转基因植株中高水平表达。 De Neve在拟南芥菜和烟草中表达了抗体IgG1 的Fab片段, 并证实两种植物表达出的抗体都具有抗原结合能力, 但表达量不同。 1999年, Bouquin成功地在拟南芥中表达了人源性抗IgG1全长抗体。 Kathuria等成功地在烟草中表达了抗HCG的全长抗体, 抗体量可达烟草叶总蛋白的4%。 Merardo最近报道了在烟草植物细胞中表达抗体的scFv片段及抗HBsAg鼠单抗用于制备纯化疫苗。 Rodriguez在烟草叶中瞬时表达了抗表皮生长因子( EGF-R)的重组抗体, 并证实其可识别肿瘤细胞表面的EGF-R。 * * （2）植物表达抗体的研制方法 植物表达抗体研制包括以下一些程序 ： ①克隆抗体基因; ②构建抗体基因植物表达载体; ③抗体基因导入植物细胞或获得遗传转化植物; ④植物抗体的表达和纯化。 * 一些全抗体或Fab和scFv在细胞内表达量均不相同, 表达量的高低在很大程度上受抗体片段本身骨架的影响。 抗体重链和轻链可变区(VH 和VL ) 、以及恒定区( Fc)基因片段都可通过PCR方法从分泌抗体的杂交瘤细胞或通过噬菌体抗体库中扩增得到。 抗体基因在植物中表达需要加入植物表达启动子, CaMV35S是常用的组成性启动子, 也可利用组织特异性启动子使抗体在特定器官中表达。 抗体分泌到特定的细胞器对于抗体有效折叠和稳定是需要的。在抗体基因前加上信号肽(可来源于植物、酵母、小鼠)对抗体在特定亚细胞组分中合成和积累是重要的。已有的研究表明scFv片段C端加上内质网滞留信号肽KDEL或KDEI, 能够在细胞内获得较高水平的积累。 * 植物抗体的回收及纯化通常包含多项步骤, 如提取、沉淀、吸附、层析和渗滤等。 用植物表达完全抗体可采用不同的策略： ①把重链和轻链基因分别转化植物, 再通过有性杂交获得共表达植株 ; ②用两个基因的载体共转化同一植物, 筛选获得共表达植株, 还可把两个基因构建到同一T-DNA上, 使转基因工作更容易。 抗体基因表达与功能鉴定可首先用原生质体进行，也可筛选建立抗体分泌细胞系用于抗体的发酵生产。 抗体基因导入受体植物的途径通常是农杆菌介导法和基因枪轰击法, 其它多种转基因方法也都可采用。 * （3）　植物抗体与医药产业 植物抗体的廉价、高效、安全等优点使之成为新的研究热点。 1995年, Ma等制备了一种能识别变异链球菌细胞表面蛋白的植物抗体--分泌型二聚体IgA /G( sIgA /G) , 该抗体在烟草植物中生成并用于治疗龋病, 用这种抗体治疗自愿者,成功地防止了变异链球菌定居口腔, 疗效可达4月之久, 研究者将这种抗体作为牙膏的一种成分, 目前已进入二期临床试验, 是惟一开始大规模生产的抗体。 大豆表达的人抗单纯疱疹病毒(HSV)抗体, 在小鼠模型中能够预防HSV 的传播, 其作用和细胞产生的单抗没有区别。 水稻和小麦中表达的癌胚抗原(CEA)抗体, 用